杏丁注射液對順鉑誘導腎小管上皮細胞凋亡的抑制作用及其機制

陳軍寧,溫海濱,譚 寧

(1桂林醫學院附屬醫院,廣西桂林 541001;2桂林醫學院科學實驗中心)

杏丁注射液是銀杏葉提取物(EGb)的復方制劑,主要成分為銀杏總黃酮,對心、腦和腸等組織器官缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。順鉑是臨床常用的化療藥物,但其嚴重的腎毒性限制了其臨床應用。新近研究表明,順鉑誘導的腎小管上皮細胞凋亡在其腎毒性中發揮重要作用[1]。2008年 9月～2009年 12月,我們采用腎小管上皮細胞株NRK52E進行體外培養,觀察杏丁注射液對順鉑腎毒性的抑制作用,并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 腎小管上皮細胞株NRK52E購自中科院上海細胞庫,DMEM培養液、小牛血清(GIBICOL公司),CCK-8試劑(大連寶生物有限公司),RT-PCR反應體系(Promega公司),Casepase-3 mRNA引物由上海賽百盛生物技術有限責任公司合成,杏丁注射液(貴州益佰公司),順鉑(云南個舊生物有限公司)。實驗分為陰性對照組、2μg/ml、4 μg/m l、8μg/m l三種濃度順鉑組、順鉑+杏丁(4 μg/m l)組。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 NRK52E細胞置于含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素的DMEM培養液中,37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。每 2 d換液 1次,4 d傳代。

1.2.2 細胞增殖測定(CCK-8法) 取對數生長期NRK52E細胞,待生長至近融合狀態,加入含0.25% EDTA的PBS消化,接種于96孔板,置CO2培養箱培養 24 h后加入藥物,在培養箱中繼續培養 24、48、72、96、120、144、168 h加入10μl CCK-8混合液,振蕩10 s繼續培養2 h后吸出上清液,上流式細胞儀于450 nm處測OD值(A值),細胞存活率的計算公式：細胞存活率 =實驗組 A值/對照組 A值 × 100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 用含 10%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞濃度為1×106/ ml,置5%CO2、37℃培養箱中培養 12 h后,用含0.5%小牛血清的DMEM培養液繼續培養24 h。各實驗組加入藥物,對照組不加藥,分別作用 24 h后收集貼壁細胞,制成單細胞懸液,70%乙醇固定,4℃保存過夜,-20℃保存。檢測前用PBS洗去固定液,加入20μl RnaseA,37℃孵育,加入PI染液,調整細胞濃度為 1×105～1×106/ml,上流式細胞儀檢測,激發波長488 nm,用Multicycle DNA分析軟件測定細胞凋亡。

1.2.4 RT-PCR檢測Survivin mRNA水平 取NRK52E細胞加入藥物后作用24 h后TRIzol一步法提取總RNA,取1μl總RNA以10μl體系逆轉錄,制備cDNA,并稀釋30倍備用。Caspase-3 mRNA上游引物：5′-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3′,下游引物：5′-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3′,擴增產物365 bp;β-action上游引物：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3′,下游引物：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′,擴增產物243 bp。擴增后取擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0軟件進行數據處理,結果以±s表示,組間比較采用兩兩比較的 t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測細胞生長結果 以 2、4、8 μg/m l順鉑分別干預NRK52E細胞,結果顯示順鉑對NRK52E細胞有明顯的細胞毒性作用,隨順鉑濃度增加細胞存活率逐漸下降,呈明顯的劑量依賴關系(P＜0.05)。見圖1。杏丁預處理24 h后再加入順鉑,結果顯示,杏丁能顯著降低順鉑對NRK52E細胞生長的抑制作用(P＜0.05)。

圖1 杏丁對順鉑致NRK 52E細胞毒性的影響

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡結果 隨著順鉑濃度的增加,G0/G1期細胞明顯減少,G2/M期及 S期細胞明顯增多,細胞凋亡率明顯上升(P＜0.05)。杏丁預處理 24 h后再加入順鉑,細胞凋亡率明顯下降(P＜0.05)。

表1 杏丁對順鉑致NRK 52E細胞凋亡的影響(%)

2.4 RT-PCR檢測結果 RT-PCR檢測結果顯示,杏丁可明顯抑制Caspase-3的表達上調。見圖2、圖3。

圖2 順鉑致NRK 52E細胞Casepase-3m RNA的表達

圖3 杏丁聯合順鉑對NRK 52E細胞Casepase-3mRNA表達的影響

3 討論

順鉑是廣譜抗腫瘤藥,其療效與劑量成正比。但順鉑是細胞周期非特異性藥物,無明確的靶向組織,故毒副作用也較多。腎毒性是順鉑常見且影響較大的毒副作用之一,其發生率和損傷程度與順鉑的劑量呈正比,隨順鉑劑量增加而加重。在Caspase依賴型凋亡途徑中,細胞凋亡途徑可分為線粒體途徑(內源性)、死亡受體途徑(外源性)以及內質網途徑。研究發現,順鉑引起的腎小管上皮細胞凋亡是通過線粒體途徑和死亡受體途徑完成的[2]。在線粒體途徑中,線粒體不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心,而且是細胞凋亡調控中心和細胞生命活動控制中心。研究表明,細胞色素 C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟。死亡受體途徑由Fas與FasL結合,從而啟動凋亡信號。Park等[3]研究發現,在順鉑誘導LLC-PK1細胞發生凋亡的過程中,順鉑能誘導Bax分子的激活,進而使細胞線粒體膜的通透性增加,細胞色素 C從線粒體釋放增加,并激活Casepase-9,進而啟動內源性細胞凋亡途徑。Tsuruya等[4]在體內和體外研究均發現Fas-FasL及TNF-TNFR1途徑參與了順鉑誘導的細胞凋亡。

藥理研究表明,EGB具有抗氧化、清除自由基、抑制LDL氧化修飾、保護血管內皮細胞的功能。近年來,隨著研究的深入,EGB在細胞凋亡中的作用也漸漸受到重視。Xin等[5]認為,EGb可能通過上調Bcl-2、下調Bax、改變Bcl-2/Bax比值來抑制神經細胞凋亡,對腦缺血再灌注損傷起保護作用,縮小腦梗死體積。Smith等[6]的實驗表明,EGB能上調PC12細胞的Bcl-2表達,抑制Caspase-3激活,下調Caspase-12,減少細胞色素C釋放和DNA斷裂,從而減少細胞凋亡。王琳等[7]報道,EGB能抑制TNF-α誘導的人腎小管上皮細胞凋亡。本實驗結果顯示,腎小管上皮細胞經順鉑誘導后細胞凋亡數明顯增多,而杏丁注射液能明顯減少腎小管上皮細胞凋亡,且Casepase-3 mRNA表達顯著降低,說明杏丁注射液可能通過抑制腎小管上皮細胞Casepase-3表達從而抑制細胞凋亡,繼而對腎小管上皮細胞起到保護作用。這一研究結果不僅有助于進一步了解順鉑致腎損傷的發生機制,而且對尋求藥物作用靶向治療具有指導意義,為臨床防治順鉑致腎損傷提供了理論依據。

[1]Okuda M,MasakiK,Fukatsu S,et al.Role of apoptosis in cisplatin-induced toxicity in the renalepithelialcell line LLC-PK 1.Implication of the functions of apical membranes[J].Biochem Pharmacol,2000,59(2)：195-201.

[2]Wang X.The expanding of m itochondria in apoptosis[J].Genes Dev,2001,15(22)：2922-2933.

[3]Park MS,De Leon M,Devarajan P.Cisplatin induces apoptosis in LLC-PK 1 cells via activation ofmitochondrial pathways[J].JAm Soc Nephrol,2002,13(4)：858-865.

[4]Tsuruya K,Tokumoto M,Ninom iya T,et al.Antioxidant ameliorates cisplatin-induced renal tubular cell death through inhibition of death receptor-mediated pathways[J].Am J Physilo,2003,285 (2)：208-218.

[5]XinW,WeiT,Chen C,etal.Mechanismsofapoptosis in rat cerebellar granule cells induced by hydroxyl radicals and the effects of EGb761 and its constituents[J].Toxicology,2000,148(2-3)：103-110.

[6]Smith JV,Burdick AJ,Golik P,et al.Amti-apoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb 761 in differentiated PC12 cells[J].Cell Mol Biol,2002,48(6)：699-707.

[7]王琳,徐西振,凃玲.銀杏葉提取物抗腫瘤壞死因子-α誘導的人腎小管上皮細胞凋亡及機制[J].華中科技大學學報,2008, 37(2)：181-184.