黑斑蛙視網膜3種神經內分泌細胞的免疫組織化學定位

詹 廳 李 晉 戴光云 張盛周

(安徽師范大學生命科學學院,蕪湖 241000)

黑斑蛙視網膜3種神經內分泌細胞的免疫組織化學定位

詹 廳 李 晉 戴光云 張盛周＊

(安徽師范大學生命科學學院,蕪湖 241000)

目的 研究神經肽 Y(NPY)、五羥色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)免疫陽性細胞在黑斑蛙(Rana nigromaculata)視網膜上的組織學定位。方法 應用過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SP法)免疫組織化學技術,并結合生物統計學分析。結果 NPY細胞主要分布于內核層和節細胞層。內核層中出現兩種陽性細胞,一種出現在第2、3亞層,常為多個細胞聚集;另一種出現在內側,有突起伸入內網層。節細胞層陽性細胞分布較少,胞體有大小之分。5-HT細胞主要分布于內核層和節細胞層,位于內核層中鄰近內網層一側的陽性細胞有突起延伸入內網層。GLU細胞分布于外核層、內核層內側以及節細胞層。結論 黑斑蛙視網膜上NPY、5-HT和 GLU細胞的分布與其它物種有相似之處,也有其自身特點,符合其晨昏性生活習性。

黑斑蛙;視網膜;神經肽Y;5-羥色胺;胰高血糖素

神經內分泌細胞(Neuroendocrine cells, NECs)是一類含神經遞質、神經調質或神經肽類激素的細胞,廣泛分布于機體各類器官組織中,參與多種調節作用[1]。研究表明,各類脊椎動物視網膜中均存在多種神經內分泌細胞,但不同物種視網膜神經內分泌細胞的分布、密度和形態均存在較大種間差異[2-12]。黑斑蛙(Rana nigromaculata)俗稱田雞,屬兩棲綱無尾目蛙科。在我國分布很廣,屬兩棲類的優勢種群,具有重要的生態價值和經濟價值,也是重要的科研和教學用實驗動物。目前對黑斑蛙視網膜的組織結構已有研究[13],但其視網膜神經內分泌細胞方面的資料尚缺。本研究探討了神經肽Y(NPY)、五羥色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)細胞在黑斑蛙視網膜上的分布和形態,旨在豐富比較內分泌學知識體系,增進對黑斑蛙視覺生理的認識,為該物種的生態保護和人工養殖提供基礎資料。

材料和方法

1.材料

鮮活的成體黑斑蛙10只,采自蕪湖市市郊,重70-95g,雙毀髓后迅速取下完整眼球。整體Bouin’s液固定5-7d后,去除眼球前半部分,小心將視網膜撥出。常規脫水透明,石蠟包埋,切片(5-7μm),貼片。

2.主要試劑

神經肽 Y(Neuropeptide Y,NPY)兔抗血清購自武漢博士德生物工程有限公司,五羥色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)和胰高血糖素(Glucagon,GLU)兔抗血清為美國ZYMED公司產品。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(Streptavidin Peroxidase,SP)免疫組織化學試劑盒購自北京中山生物技術公司。

3.免疫組織化學方法

常規石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2甲醇溶液孵育5min,消除內源性過氧化物酶的活性。蒸餾水浸洗,PBS浸泡 5min,滴加正常山羊血清(1: 10)室溫孵育10min,封閉非特異性反應部位。傾去血清,滴加一抗,4℃過夜。PBS浸洗3次× 5min,滴加即用型生物素標記的二抗(羊抗兔IgG抗血清),室溫孵育1h。PBS浸洗3次×5min,滴加即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶,室溫1h。PBS浸洗 3次×5min,DAB-H2O2顯色,自來水洗凈,脫水,透明,封片。陰性對照分別用正常羊血清和PBS代替一抗,其余步驟同上。

4.觀察與計數

在德國萊卡DM2500型顯微鏡下觀察、拍照。免疫陽性細胞呈棕黃色,背景呈淺藍或淡黃色。對每例視網膜切片隨機取10個單位面積(100μm× 100μm)進行細胞計數,取平均值(±s)表示陽性細胞的分布密度。用SPSS軟件獨立樣本 T檢驗進行比較分析。

結 果

光學顯微鏡下,黑斑蛙視網膜具有典型的十層結構,由外向內依次為色素上皮層、視桿視錐層、外膜層、外核層、外網層、內核層、內網層、神經節細胞層、神經纖維層和內膜層(圖 1)。視網膜上免疫陽性細胞呈深棕色,背景呈淺藍或淡黃色,容易區分。

1.NPY細胞

NPY免疫陽性細胞主要分布于內核層和節細胞層,總體分布不均。內核層陽性細胞平均密度為39.5±13.7個/mm2,節細胞層為 5.5±2.5個/ mm2。兩層分布密度有顯著差異(P<0.05)。其中內核層陽性細胞可分為兩種類型,一種發生于內核層的外側及第2、3亞層(S2、S3),常為2-3個圓形細胞聚集,胞體較小,直徑為5-10μm,陽性較強,胞體周圍有突起(圖2a)。另一種出現在內核層中鄰近內網層的一側,呈圓形或卵圓形,胞體亦較小,陽性較弱,并且多數胞體周圍有突起伸入內網層的外側(圖 2b),形態上觀察為無長突細胞。偶爾可見突起伸入內網層第1亞層(S1)后再分出小分枝延伸至內網層第3亞層(S3)(圖2b)。節細胞層陽性細胞密度較小,細胞呈圓形,胞體有大小兩種,直徑分別為 10-12μm和 20-25μm,形態上可判斷為移位的無長突細胞(圖2a,2b)。

2.5 -HT細胞

5-HT免疫陽性細胞主要分布于內核層和節細胞層,分布不均。內核層平均密度為37.5±10.1個/mm2,節細胞層平均密度為 12.5±6.4個/ mm2,兩層分布密度有顯著差異(P<0.05)。內核層陽性細胞主要位于鄰近內網層的一側,胞體為圓形或橢圓形,胞外突起延伸入內網層不同亞層。節細胞層陽性細胞密度較小,細胞多呈圓形(圖3)。

3.GLU細胞

GLU免疫陽性細胞主要出現在外核層、內核層內側和節細胞層。外核層與內核層陽性細胞分布較均一,平均密度分別為 17.5±5.4個/mm2和31.2±7.4個/mm2;節細胞層數量較少,主要分布偏于中央區域,平均密度為7.5±3.2個/mm2。三層分布密度無顯著差異(P>0.05)。各層陽性細胞多數呈圓形或橢圓形,其中內核層陽性細胞分布于內側,鄰近內網層,胞外可見突起伸入內網層;節細胞層陽性細胞胞體較大,胞外有突起伸入內網層(圖4)。

在內核層和節細胞層內分別對以上3種免疫陽性細胞的分布進行兩兩比較,結果顯示均無顯著差異(P>0.05)。

討 論

脊椎動物視網膜具有十層基本結構。大多數動物NPY細胞主要分布于內核層和節細胞層,如蜥蜴、小鼠、大鼠等[2-4],黑斑蛙與這些動物相一致。不過,人類視網膜中NPY免疫陽性反應多發生在網狀細胞層[5]。蟾蜍僅分布于內核層,節細胞層未見[6]。牛蛙則除內核層外,外核層亦有較強的陽性反應,且節細胞層陽性細胞體積較小[7]。黑斑蛙外核層未發現有陽性反應,且節細胞層陽性細胞體積較大。黑斑蛙 NPY細胞密度遠小于小鼠和大鼠[3,4],與蟾蜍相當[6]。5-HT和 GLU在視網膜中的分布研究較少。雞視網膜5-HT細胞主要分布于內核層,延伸入內網層[8]。牛蛙視網膜5-HT細胞位于內核層1/3外側端和最內側[9]。本研究則發現黑斑蛙視網膜5-HT細胞主要集中于內核層內側。之前有研究顯示蛙類節細胞層和內網層中存在GLU細胞,未提及內核層[10]。東方蠑螈 GLU細胞主要分布于網間細胞層,即一面有突起伸入外網層,另一面穿過內核層伸入內網層[11]。本研究顯示黑斑蛙GLU細胞主要出現在外核層和內核層內側,節細胞層亦有少量分布。綜上可見,黑斑蛙視網膜NPY、5-HT和GLU細胞的分布與其它物種有相似之處,也有其自身特點,具有明顯的種間特異性。

研究表明,黑斑蛙視網膜的組織結構與其晨昏性生活習性是相適應的[13]。體內外實驗表明NPY和5-HT參與了晝夜節律的調節[12,14],提示NPY和5-HT可能與動物的晝行性與夜行性有關。黑斑蛙視網膜NPY和5-HT細胞的分布及密度與夜行性鼠類和晝行性人類均有較大差別,這種差異亦可能與其晨昏性生活習性有關,有待進一步的研究。

NPY在開始分析有結構的視覺信息時出現表達峰值[15],暗適應條件下雞視網膜中5-HT濃度增加[8],說明NPY和5-HT與視覺形成有關。但本研究顯示NPY和5-HT并沒有分布于黑斑蛙視網膜感光層,推測其只是作為一種調節因子或神經遞質,接收來自感光層的信號。5-HT可能在生物鐘中起神經遞質作用[14],NPY可以誘導5-HT在視網膜上的釋放[16]。GLU與視覺散焦有關[17],雞及本研究的黑斑蛙視網膜GLU細胞均在外核層中有分布,提示其可能參與了感光機能[18]。此外, GLU能誘導視網膜上cAMP的形成[19],而NPY則能抑制其形成[15]。本研究顯示 GLU與NPY均在內核層、節細胞層中有分布,推測二者可能是在內核層及節細胞層內通過雙向控制cAMP來共同調控視網膜的某些機能?？梢?NPY、5-HT和 GLU對視覺的形成均起著重要作用,并且三者之間關系密切,共同參與對視網膜功能的調節。

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圖 版 說 明

圖1 視網膜組織結構,示視網膜10層結構。PE:色素上皮層;RCL:視桿視錐層;OLM:外界膜;ONL:外核層;OPL:外網層;INL:內核層;IPL:內網層;GCL:節細胞層;NFL:神經纖維層;ILM:內界膜。HE染色,標尺=50μm。

圖2 NPY陽性細胞主要分布在內核層和節細胞層。內核層中出現兩種陽性細胞,一種為多個細胞聚集(圖2a,↑↑),另一種出現在內核層內側,有突起伸入內網層(圖2a,2b,▲),有些突起伸入內網層 S3(圖2b,△△);節細胞層陽性細胞分布較少,胞體有大小兩種(圖2a,小胞體;圖2b,大胞體;↑)。SP法,標尺=50μm。

圖3 5-HT陽性細胞分布于內核層和節細胞層。分布于內核層中鄰近內網層一側有突起伸入內網層(▲)。節細胞層有少量分布(↑)。SP法,標尺=50μm

圖4 GLU陽性細胞分布于外核層(△)、內核層(▲)和節細胞層(↑)。內核層有突起伸入內網層。SP法,標尺=50μm。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The histological structure of the retina ofRana nigromaculata,showing 10 layers structure.PE:Pigment epithelia layer;RCL:Cones and rods layer;OLM:Outer limiting membrane;ONL:Outer nuclear layer;OPL:Outer plexiform layer;INL:Innernuclearlayer;IPL:Innerplexiform layer;GCL:Ganglion cell layer;NFL:Nerve fibers layer;ILM:Inner limiting membrane.HE staining, Scale=50μm.

Fig.2 NPY positive cells are localized in INLand GCL.There are two types of cells in the INL.The cells of one type are usually collected each other(2a,↑↑).The other type is found in the inner part of the INLwith the processes ramified into IPL(2a,2b,▲),while some ramified into S3 ofIPL(2b,△△).Less cells are found in the GCLwith small or large cell bodies(2a,small,↑;2b,larger,↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.3 5-HT positive cells are present in INLand GCL.The cells in the INLare close to INL/IPLborder with their processes to the IPL(▲).Less cells are found in the GCL(↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.4 GLU positive cells are localized in ONL(△),INL(▲)and GCL(↑).In the INL,their processes are ramified into the IPL.SP method,Scale = 50μm.

IMMUNOHISTOCHEMICALLOCALIZATION OF THREE TYPES OF NEUROENDOCRINE CELLS IN THE RETINA OFRANA NIGROMACULATA

Zhan Ting,Li Jin,Dai Guangyun,Zhang Shengzhou＊
(College of Life Science,Anhui Normal University,Wuhu241000,China)

Objective To investigate the histological localization of neuropeptide Y(NPY),5-hydroxytryptamine(5-HT)and glucagon(GLU)immunohistochemical positive cells in the retina ofRana nigromaculata.Methods Streptavidin peroxidase(SP)immunohistochemical method was used with biological statistical analysis.Results NPY cells were mainly localized in the inner nuclear layer(INL)and the ganglion cell layer(GCL).Two types of cells were found in the INL.One lay in strata 2 and 3(S2, S3),usually in clusters.The other was in the inner part of the INL,with their processes ramified into the inner plexiform layer(IPL).In the GCL,the positive cells were scattered with different sizes.The 5-HT cells were present in the INLand GCL.The cells in the INLclose to the INL/IPLborder extended their processes to the IPL.GLU cells were localized in the outer nuclear layer(ONL),INLand GCL.These cells in the INLand GCLhad their processes ramified into the plexiform layer.Conclusion Compared with other animals,there are both common and specific features in the distribution of NPY,5-HT and GLU cells in the retina ofRana nigromaculata,which is in accordance with its twilight habit.

Rana nigromaculata;Retina;Neuropeptide Y;5-Hydroxytryptamine;Glucagon

R329.3

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.009

2010-03-22

2010-06-07

安徽師范大學生物大分子進化重點實驗室開放基金(2006B001),"動物生物學"安徽師范大學優秀學術團隊基金,生物環境與生態安全省級重點實驗室及安徽省重要生物資源保護與利用重點實驗室建設基金資助

詹廳,女(1984年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)