豬肉復合酶解及其熱反應產物揮發性成分分析研究

沈 晗,孫寶國,廖永紅,肖 陽

(北京工商大學化學與環境工程學院,北京 100048)

豬肉復合酶解及其熱反應產物揮發性成分分析研究

沈 晗,孫寶國,廖永紅＊,肖 陽

(北京工商大學化學與環境工程學院,北京 100048)

比較 14種蛋白酶酶解豬肉水解度大小與其熱反應產物風味,篩選出水解度較大,風味較好的 Trypsin、Papain、Neutrase(powder)、Novozymes Flavorase、Novozymes Protamex、Alcalase 2.4L、Protex6L酶進行L18(37)正交實驗,得水解度最大的復合酶組合為A3B3C3D2E3F2G3,其最適酶解條件為加酶量 250U/g豬肉、60℃、自然 pH、2.5h,GC-MS分析酶解物熱反應肉味香精揮發性成分的主要風味物質為醇類和醛類,其中苯甲醛與糠醛與肉味關系密切。

蛋白酶,酶解,水解度,熱反應,GC-MS

1 材料與方法

1.1 實驗材料

里脊豬肉 市售;各種蛋白酶制劑 龐博和諾維信酶制劑有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶活力測定 Folin-酚法[5]。

1.2.2 總氮含量測定 凱氏定氮法[6]。

1.2.3 游離氨基氮測定 甲醛滴定法[7]。

1.2.4 水解度 (DH)測定[8]DH(%)=h/htot×100%

式中：h-水解后每克蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數;htot-每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數。

1.2.5 豬肉酶解 定量稱取豬肉糜 (肉∶水 =2∶1, m/v),用 0.1mol/L的NaOH或 HCl調至蛋白酶作用最適 pH,添加一定量酶,在最適溫度下的水浴搖床中酶解一定時間,95℃滅酶 5min,冷卻。

1.2.6 熱反應 將一定量還原糖加入豬肉酶解物中,110℃熱反應 2h,即得肉味香精,冷卻,編號,待評價。

晚上回到家，我對穎春說了縣里地震的事，穎春卻什么也不說，只是一個勁地笑。我覺得她笑得有些奇怪，便問，你笑個什么鬼喲？穎春點著我的額頭說，地震好??！那些人倒臺了，不是正好給你留下位置了嗎？

1.2.7 肉味風味評價 選 10個評分人,其中 3名為專業人士,肉味強弱分 10等級,從弱到強分別計1～10分,打亂樣品順序由評分人按標準方法單獨評分,專業人士得分權重占 0.6,其他評分人得分權重占 0.4,統計評分結果。

1.2.8 GC-MS分析肉味香精揮發性風味物質 取5g肉味香精于 50℃用 SP ME(固相微萃取)法萃取30min,利用 GC-MS對其揮發性風味物質進行分析,其中 GC條件為：柱溫 250℃,不分流,進樣量為1.0mL/min,H240.0mL/min,Air 450mL/min,程序升溫起始 50℃,保留 3min,以 6℃/min升至 200℃,保留 2min,再以 10℃/min升至 300℃,保留 2min。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶活力測定

由于蛋白酶在貯藏過程中,酶活力逐漸喪失,所以對收集到的 14種蛋白酶進行實際酶活力的測定,本實驗酶添加量均按活力計算。采用 Folin-酚法測定蛋白酶活力,結果見表 1。

表1 14種蛋白酶酶活力測定結果

2.2 單一蛋白酶酶解效果與風味比較

2.2.1 單一蛋白酶酶解效果比較 將14種蛋白酶分別編號 1#～14#,按 1.2.5方法在各酶最適 pH、溫度下進行豬肉蛋白酶解,酶添加量見表 2。在不同時間取樣測定DH,作各酶酶解時間與DH曲線如圖1。

表 2 1#～14#蛋白酶添加量

在酶的作用下豬肉蛋白逐漸被水解,得到的短肽和氨基酸數量不斷增加。隨著反應繼續進行,底物減少,酶解作用減慢,曲線趨于平緩。由圖 1可知：4#酶水解作用最強,最大DH達 46.3%,取 1#、4#、5#、7#、8#、10#、13#、14#酶解作用時間為 3h,2#、9#、11#酶解作用時間為 2.5h,3#、6#酶解作用時間為 2h。

圖 1 1#～14#蛋白酶DH與時間曲線

2.2.2 單一蛋白酶酶解物熱反應產物風味比較 將1#～14#酶酶解豬肉蛋白的酶解物按 1.2.6方法進行熱反應,對其產物風味按 1.2.7的方法進行評分統計,將酶解作用的DH大小與對應熱反應產物的風味得分比較見圖2。

圖 2 蛋白酶酶解作用的DH與酶解物熱反應風味得分比較

從圖 2得知,4#、5#、6#、14#酶解作用 DH較大,且對應的熱反應產物風味較好,而 7#、12#、13#酶解作用DH較小,對應熱反應產物風味得分卻較高,其它酶酶解作用的DH較低,對應熱反應產物風味不佳,說明獲得較好熱反應風味產物與酶種類及其DH大小相關。

2.3 蛋白酶復合及酶解條件優化

不同蛋白酶酶切位點不同,水解度各異,復合蛋白酶解具有比單一酶更高的酶解效率,不僅 DH大,原料利用率高,而且酶解產物種類多、所得酶解液提供種類和數量更多的氨基化合物參與Maillard熱反應,可以獲得更豐富的風味物質。為了追求原料更高的利用率和良好的風味,本實驗選擇 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶復合,并進行復合酶解條件優化,以獲得最大DH。

2.3.1 蛋白酶復合配比的確定 將 4#、5#、6#、7#、12#、13#、14#蛋白酶重新編號為 A～G,以酶種類為因素、加酶量為水平(見表 3)、DH為指標進行L18(37)正交實驗,其它酶解條件為自然 pH、溫度 60℃、酶解時間2h,酶解結果見表 4和表 5。

表3 復合蛋白酶酶解因素水平表

從表4的R值可以得出,各酶對DH影響大小的關系是A＞B＞G＞E＞C＞D＞F。最優的復合酶組合為 A3B3C3D2E3F2G3,該酶組合下實測 DH為42.88%,比表 4各實驗號的 DH均大,所以證明該組合選擇正確。雖然最大復合酶解的DH比 4#單一酶解的DH(46.3%)略低,但復合酶添加量總和為 250 U/g豬肉,僅不到 4#酶解添加量 (508U/g豬肉)的一半,說明復合酶的酶解效率更高。

表 4 復合蛋白酶酶解正交實驗結果

表5 復合蛋白酶解DH方差分析

2.3.2 復合酶酶解條件優化 對復合酶(A3B3C3D2E3F2G3)酶解作用的加酶量、溫度、pH、時間按表 6所示因素水平進行條件優化,實驗結果見表7和表8。

表6 復合酶酶解條件優化因素水平表

從表7的R值可知,各因素對DH的影響作用為加酶量 ＞溫度 ＞pH＞時間,加酶量對 DH的影響顯著,所以繼續提高加酶量可增大DH。最優的復合酶酶解條件是加酶量為 250U/g豬肉、溫度 60℃、自然pH、時間 2.5h,該酶解條件下測定的 DH為 43.11%,比表 8各實驗號 DH均大,說明該最適酶解條件正確。

表8 復合酶酶解條件優化DH方差分析

2.4 熱反應產物風味評價及物質分析

2.4.1 熱反應產物風味評價 對復合酶(A3B3C3D2E3F2G3)在最適酶解條件下的豬肉蛋白酶解物的熱反應產物按 1.2.7的方法進行風味評價,得分為8.7,產物具有濃郁的豬肉香味,并具有較好的烤香。

2.4.2 熱反應產物中風味物質的 GC-MS分析 采用1.2.8方法中的參數對復合酶解熱反應產物中的揮發性風味物質進行 GC-MS分析,得 GC-MS圖譜,見圖 3。收集各峰進行檢索,確定風味物質名稱及峰面積大小,見表 9。

從表 9可知,肉味香精揮發性風味成分中含量最多的物質是順式-2,3-氧辛烷、反式-2-戊烯酸乙酯,其次是 3-糠醛、3-環戊烯-1,2-二醇、苯甲醛等,其中糠醛具有肉香味和烤香味,苯甲醛具有苦杏仁味,具有導致氣味加成或協同作用的效果,是非常有效的風味修飾劑[9],這兩種物質與香精肉味有密切的關系。從物質分類上,醇類最多,有 6種,以 3-環戊烯-1,2-二醇含量最高;其次是醛類,有 5種;其它還有呋喃類、烷烴類、烯烴類等物質。

圖3 復合酶解熱反應產物的 GC-MS圖譜

表 9 復合酶解熱反應揮發性風味成分及含量

3 結論

3.1 不同蛋白酶水解豬肉蛋白的 DH不同,酶解物熱反應產物風味與酶種類和DH相關。

3.2 復合酶具有比單酶更高的水解效率,為了獲得原料最大利用率及較好的熱反應產物風味,需使酶解作用的DH最大化。對蛋白酶進行復合得最佳復合酶組合為 A3B3C3D2E3F2G3,其酶解最適條件為加酶量 250U/g豬肉、60℃、自然 pH、2.5h,DH達43.11%。

3.3 對復合酶酶解豬肉蛋白熱反應產物進行 SP ME -GC-MS分析,得其主要的風味物質為醇類和醛類,與肉味具有較大關系的風味物質是 3-糠醛、苯甲醛等。

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Study on hydrolysis of pork enzymatic hydrolysis by complex proteases and analysis of the volatile components ofMaillard reaction products

SHEN Han,SUN Bao-guo,L IAO Yong-hong＊,XIAO Yang
(School of the Chemical and Environmental Engineering,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China)

By comp a ring the DH and tas te of the14p roteases hyd rolyza tes of p ork p rote in,Tryp s in,p ap a in,neutra l p rotease,Novozym e flavourzym e,Novozym e p rotam ex,a lca lase2.4L and p rotex6L we re se lec ted to be tes ted in orthogona l exp e r im ent.The bes t com b ina tion of the b igges t DH was A3B3C3D2E3F2G3,its op t im um cond ition was p rotease quantity250U/g p ork,60℃,na tura l pH,2.5h.M a illa rd reac tion p roduc ts we re ana lyzed by GC-MS,the flavor subs tances which m a inly we re a lcohol,a ldehydes and so on,furfura l and benza ldehyde had a c lose re la tionship w ith the p orc ine flavor.

p rotease;enzym a tic hyd rolys is;DH;M a illa rd reac tion;GC-MS

TS251.1

A

1002-0306(2010)02-0104-04

肉是人類的重要食物,肉香味是人類飲食中最重要的香味之一,熱反應是肉味香精形成的最主要的途徑之一[1]。通過蛋白酶酶解肉蛋白可以獲得很多肉味前體物質,如游離氨基酸、胺、多肽等[2],這些氨基化合物與羰基化合物可進行羰氨反應(Maillard熱反應,后簡稱熱反應),產生醛、酮、酯類等具有特殊風味的物質[3]。蛋白酶分內切酶和外切酶,不同的蛋白酶具有不同的酶切位點,酶解產生的氨基化合物也不同,復合蛋白酶解不僅使得酶解效率大大提高,而且提供更多不同種類和數量的氨基化合物,通過熱反應產生性質和種類不同的風味物質,形成不同的風味。本實驗通過比較 14種蛋白酶的水解度(DH)與酶解產物熱反應產生肉風味的強弱篩選出 7種蛋白酶進行復合,并對復合蛋白酶的酶解條件進行優化,通過 GC-MS對酶解物熱反應肉味香精風味物質進行分析[4],比較酶解與風味的關系。

2009-08-07 ＊通訊聯系人

沈晗 (1985-),男,碩士研究生,研究方向：食品生物技術。

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAK36B05)。