谷氨酸轉運體基因多態性與犬行為性狀的關聯性分析

徐 黎 葉俊華 楊前勇 馬長書 付平峰 李德貴 楊利國

谷氨酸轉運體基因多態性與犬行為性狀的關聯性分析

徐 黎 葉俊華 楊前勇 馬長書 付平峰 李德貴 楊利國

興奮性氨基酸是廣泛存在于哺乳類動物中樞神經系統的正常興奮性神經遞質，參與突觸興奮傳遞，學習記憶形成以及與多種神經變性疾病有關。EAA包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）、亮氨酸等等。其中谷氨酸是中樞神經系統內含量最高的氨基酸。目前有學者認為在中樞神經系統（CNS）損傷中，興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的失衡，對激發興奮毒性起一定作用，故是造成腦損傷的因素之一。

γ氨基丁酸（GABA）與谷氨酸是一對重要的抑制與興奮性神經遞質，兩者的平衡對維持腦功能至關重要。細胞外液GLU濃度過高，對腦有損傷作用因改變血腦屏障通透性，從而導致腦組織損害。如果谷氨酸代謝發生改變，勢必會造成中樞神經激發興奮性中毒，所以在谷氨酸代謝過程中，起到重要作用的谷氨酸轉運體基因家族對于保護中樞神經系統有其重要的作用。谷氨酸轉運體基因家族包括：谷氨酸/天門氨酸轉運體基因（GLAST）、谷氨酸轉運體基因－1（GLT-1）、興奮性氨基酸轉運體基因－3（EAAT3）、興奮性氨基酸轉運體基因－4（EAAT4）和興奮性氨基酸轉運體基因－5（EAAT5）。Niwako（2006）等利用直接測序的方法，在犬GLT-1基因的編碼區發現了同義突變，分別統計了5個品種193只犬的基因型頻率，發現品種之間基因型頻率品種之間差異顯著。本文選擇谷氨酸/天門氨酸轉運體基因（GLAST）和谷氨酸轉運體基因－1（GLT-1）兩個基因系統作為犬行為候選基因，旨在希望獲得與犬行為密切相關的SNP位點，為以后犬早期輔助選擇和犬指導訓練奠定一定的理論基礎。

一、材料和方法

（一）試驗動物及采樣

實驗犬來自公安部南昌警犬基地，均為成年犬。品種有德國牧羊犬60條和羅維納犬68條 (表1-1)，所有實驗犬前肢靜脈采血5ml，EDTA抗凝，-20℃保存。

表1-1 實驗犬的品種、樣本數，性別和年齡

（二）基因組DNA提取及純度檢測

血液中基因組DNA提取采用酚/仿法進行提取，用Pharmacia DNA/RNA濃度測定儀測定基因組DNA濃度和純度，OD260 nm與OD280 nm吸收比值在1.8～2.0范圍的DNA樣品純度較高。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，DNA電泳條帶為整齊、清晰的單一條帶。調整DNA終濃度至50 ng/μl，樣品保存于-20℃備用。

（三）序列擴增和多態性分析

參考NCBI提交犬的GLT-1和GLAST基因的全序列，分別在其3'-UTR區域設計一對引物（表5-1）。

PCR反應體系均為：10×Buffer1μl，25mmol/LMgcl20.6μl，10mmol/LdNTP 0.6μl，10mmol/L引物各0.5μl，Taq酶0.5U，50ng/μl DNA模板1μl，ddH2O 6.3μl。PCR反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，退火 45s，72℃延伸60s，35個循環后于72℃延伸10min，4℃保溫。

PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行回收克隆，并送北京三博公司測序。對測序結果利用NCBI在線比對軟件Blast進行比對尋找突變位點。

（四）行為測試

測試地點在公安部南昌警犬基地，測試時間為2005年9～11月。根據Miller (1985)、Hart (1985) 和Bradshaw (1996)等的測試程序 （Hart B L & Hart L A，1985；Hart & Miller，1985；Bradshaw et al，1996），根據南昌警犬基地的實際情況，適當做了一些可行合理的修改。把每個行為性狀均分成4個等級，共定義了48個行為變量。根據在犬行為測試過程中，犬的具體行為表現給予評分。

（五）統計分析

應用SAS的GLM過程構建一般線性模型計算不同基因型的行為參數的最小二乘均數和標準誤，并進行顯著性檢驗和多重比較。構建模型如下：

表5-1 用于擴增基因組序列及PCR-RFLP的引物

yijklm=μ+Gh+Bi+Sj+Ak+eijklm

yijkl為性狀觀察值

μ為分析性狀的群體均值

Gh為三種基因型

Bi為品種效應，固定效應

Gj為性別效應，固定效應

Ak為年齡效應，固定效應

eijklm為隨機殘差效應

建立單標記回歸統計模型，計算基因加性效應和顯性效應。性狀觀察值＝群體平均值＋基因加性效應＋基因顯性效應＋品種效應＋性別效應＋隨機殘差效應。加性效應用-1、0和1分別代表AA、AB和BB基因型；顯性效應用1、-1和1分別代表AA、AB和BB基因型。

二、實驗結果

（一）序列比對

對擴增的所有序列瓊脂糖檢測以后，回收、克隆和測序。對測序結果利用NCBI在線比對軟件Blast進行序列比對。結果在GLT-1基因3'-UTR區域的第2170位發現了一個T/C突變，第2227位發現了一個A/T突變（見圖5-1）；在GLAST基因3'-UTR區域發現了兩個突變位點：第2648位點的T/A突變和第2652位點的G/A突變（見圖5-2），在GLAST內含子上發現了3個突變位點（見圖5-3）。

（二）基因分型

1. GLT-1 （T2170C）位點的基因分型

由于該突變沒有引起酶切位點的改變，利用dCAPS Finder 2.0 program引入BsiYI酶切位點進行了基因分型。根據GLT-1（T2170C）引入引物進行序列擴增以后，擴增產物長為128bp，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，特異性好。經BsiYI酶切以后：TT基因型為：128bp，一條帶；TC基因型為：128bp，111bp，17bp，三條帶；CC基因型為：111bp，17bp。但是由于17bp在電泳圖沒有顯出。經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（見圖5-4）。

2. GLAST （T2648A）位點的基因分型

由于該突變沒有引起酶切位點的改變，同樣利用dCAPS Finder 2.0 program引入SspI酶切位點進行了基因分型。根據GLAST（T2648A）引入引物進行序列擴增以后，擴增產物長為157bp，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，特異性好。經BsiYI酶切以后：TT基因型為：157bp，一條帶；AT基因型為：157bp，133bp，24bp，三條帶；AA基因型為：133bp, 24bp。但是由于24bp在電泳圖沒有顯出。經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（見圖5-5）。

3. GLAST （G2652A）位點的基因分型

由于該突變沒有引起酶切位點的改變，利用dCAPS Finder 2.0 program 引入BsiYI酶切位點進行了基因分型。根據GLAST（T2648A）引入引物進行序列擴增以后，擴增產物長為498bp，經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，特異性好。由于該片段本身有兩個酶切位點，經BsiYI酶切以后: AA基因型為：249bp, 128 bp，121bp三條帶；GA基因型為：249bp，224 bp, 128bp，121bp，25bp, 五條帶；GG基因型為：224 bp, 128bp，121bp，25bp, 四條帶。但是由于25bp在電泳圖沒有顯出。2.0 %的瓊脂糖凝膠電泳（見圖5-6）。

（三）三個基因位點在兩犬品種基因型和基因型頻率分布

由表5-2可知：GLT-1(T2270C) 位點在德國牧羊犬中不存在多態性，所有個體均為TT基因型，而羅維納犬中，該位點的T等位基因和C等位基因幾乎平衡，分別為：52.2%和47.8%；GLAST(T2648A) 位點在兩個品種中，T等位基因均占有優勢地位，分別為72.5%和62.5%，且AA基因型個體在兩個品種均較少，分別為5%和3%；而GLAST(G2652A) 位點在兩個品種中，A等位基因均占有優勢地位，分別為：81.7%和70.6%。

（四）三個基因位點對犬行為性狀的影響

利用SAS統計軟件分析以后，數據顯示：GLT-1(T2170C) 對犬的食欲反射強度、自由反射強度和興奮性強度影響顯著，其中TT基因型個體的食欲反射強度明顯高于CC基因型個體（p<0.05），TC基因型個體的自由反射強度明顯高于TT基因型個體（p<0.05），而TC基因型個體的興奮轉抑制速度要高于TT基因型個體；GLAST(T2648A) 多態位點對犬的外抑制強度及超限抑制強度影響顯著，AA基因型個體的外抑制強度明顯高于TT基因型個體（p<0.001），TT基因型個體的超限抑制強度高于AA基因型個體（p<0.05）；而GLAST (A2652G) 多態位點對犬的分化抑制強度影響顯著，其中AA基因型個體的分化抑制強度低于AG型個體和GG型個體。

三、分析與討論

細胞外液谷氨酸濃度過高，對腦有損傷作用（因改變血腦屏障通透性，從而導致腦組織損害）。如果谷氨酸代謝發生改變，勢必會造成中樞神經激發興奮性中毒，所以在谷氨酸代謝過程中，起到重要作用的谷氨酸轉運體基因家族對于保護中樞神經系統有其重要的作用。國外，有些研究小組已經開始利用直接測序方法，來分析谷氨酸轉運體基因家族多態性和犬行為之間的聯系。

本實驗對犬的兩個最主要的谷氨酸轉運體基因：GLT-1和GLAST，利用分子生物學的方法進行多態性分析，結果在GLT-1基因3'-UTR區域的第2170位發現了一個T/C突變，第2227位發現了一個A/T突變；在GLAST基因3'-UTR區域發現了兩個突變位點：第2648位點的T/A突變和第2652位點的G/A突變，在GLAST內含子上發現了3個突變位點在GLAST基因。

GLT-1(T2270C) 位點在德國牧羊犬中不存在多態性，所有個體均為TT基因型，這說明C等位在德國牧羊犬這個品種上，在選擇育種的過程中具有較好的選擇壓力；利用SAS統計軟件分析以后，數據顯示：TT基因型個體的食欲反射強度明顯高于CC基因型個體（p<0.05），TC基因型個體的自由反射強度明顯高于TT基因型個體（p<0.05），而TC基因型個體的興奮轉抑制速度要高于TT基因型個體，綜合說明：T等位基因在犬行為個體中是一個相對有利的等位基因。

表5-2 三個基因位點在兩犬品種基因型分布、基因頻率及雜合度

表5-3 三個基因位點不同基因型犬的各種行為性狀最小二乘值及基因效應

GLAST(T2648A) 位點在兩個品種中，T等位基因均占有優勢地位，分別為72.5%和62.5%，且AA基因型個體在兩個品種均較少，分別為5%和3%；數據顯示：該多態位點對犬的外抑制強度及超限抑制強度影響顯著，AA基因型個體的外抑制強度明顯高于TT基因型個體（p<0.001），TT基因型個體的超限抑制強度高于AA基因型個體p<0.05），說明該位點可能會影響犬的外抑制強度及超限抑制強度。

GLAST(G2652A) 位點在兩個品種中，A等位基因均占有優勢地位，分別為：81.7%和70.6%，且AA基因型個體的分化抑制強度低于AG型個體和GG型個體，。

由于本實驗中，三個多態位點均在基因的3－UTR，隨著對基因表達調控機制的深入認識, 真核mRNA 3－UTR在基因表達調控中的作用日益受到關注. 現已闡明, 它不僅調控mRNA的體內穩定性及降解速率, 控制其利用效率,協助辨認特殊密碼子等, 而且還調控特定mRNA的翻譯時間、位點及產物。

（作者單位：徐黎、葉俊華、楊前勇、馬長書 、付平峰，公安部南昌警犬基地，330100；李德貴、楊利國，華中農業大學動物科學院，430070）

（編輯：李 冰）