不同年齡段牙髓組織比例及牙髓干細胞分布的實驗研究

鄒慧儒 YANG Xuebin Steven Brookes 秦宗長 楊 敏 何淑萍 辛 宇 張蘭成

不同年齡段牙髓組織比例及牙髓干細胞分布的實驗研究

鄒慧儒 YANG Xuebin Steven Brookes 秦宗長 楊 敏 何淑萍 辛 宇 張蘭成

目的 通過觀察不同年齡段前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒的比例，及干細胞分布情況，評估牙齒組織工程臨床適宜的選材標本。方法 臨床收集不同年齡段因正畸或其他原因拔除的無齲壞、無牙周疾病等的健康前磨牙及第三磨牙，分別稱重牙齒及牙髓并計算比例。掃描電鏡觀察牙髓表面形態。脫鈣后病理切片觀察，牙髓組織內成牙本質細胞層完整與否，觀察細胞與纖維成分比例；阿爾新藍－希爾紅染色，偏振光顯微鏡觀察有無雙折射現象；免疫組化染色觀察，間充質干細胞特異性標記物STRO-1以及成牙本質相關蛋白牙本質涎蛋白DSP的表達情況，評估牙髓干細胞在牙髓組織中的分布情況。結果 隨著年齡的增長，前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒比例逐漸縮小，11～20歲年齡段與31～40歲、41～50歲，以及50歲以上年齡段比較，有統計學差異。掃描電鏡下可見摘除的牙髓組織類似樹樁，有些區域比較平滑，有些區域表面有不規則突起。牙髓組織內存在雙折射。STRO-1陽性表達細胞在牙髓組織中散在分布，在血管周圍較密集。DSP表達則主要集中在牙本質區域及成牙本質細胞內，牙髓內僅有少量表達。結論 隨著年齡的增長，牙髓逐漸萎縮，牙髓干細胞的分布集中于血管周圍，在牙髓組織內散在分布，未分化的牙髓干細胞不表達成牙本質相關蛋白DSP。

人牙髓組織 牙髓干細胞 分布 STRO-1 牙本質涎蛋白

牙髓干細胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）是一組在乳牙和恒牙牙髓中都存在的成體干細胞(Adult stem cells，ASCs)。研究表明，牙髓干細胞可以分化成骨、軟骨、肌肉、神經，以及形成牙髓牙本質復合體等，可以作為機體多個臟器或組織再生所需的組織工程種子細胞來源[1-4]。牙髓內廣泛存在著牙髓干細胞，但是牙髓干細胞在不同年齡段的牙髓內的分布情況尚不清楚。本實驗旨在收集不同年齡段的健康前磨牙及第三磨牙，采集牙髓組織，測算牙髓占牙齒比例，觀察牙髓組織形態、細胞及纖維構成，通過檢測干細胞相關標記物STRO-1和成牙本質細胞相關蛋白牙本質涎蛋白 （Dentine sialoprotein，DSP）的表達，檢測在不同年齡段的牙髓組織內牙髓干細胞的分布情況。

1 材料和方法

1.1 材料

利茲大學口腔醫院及天津市口腔醫院口腔外科門診因正畸或其他原因拔除的健康前磨牙及第三磨牙的新鮮標本。

1.2 主要試劑和儀器

STRO-1、DSP鼠抗人單克隆抗體（SantaCruz，USA）及免疫組化染色試劑盒（EnVision System，Japan）；電子稱重儀、組織切片機、偏振光顯微鏡、掃描電子顯微鏡。

1.3 牙髓占牙齒比例測定

收集不同年齡段 （11～20歲、21～30歲、31～40歲、41～50歲，以及50歲以上）因正畸或其他原因拔除的無齲壞、無牙周疾病等的健康前磨牙或第三磨牙，清理干凈牙齒表面污穢以及頸部牙齦或根面牙周膜附著之后，稱重牙齒并記錄，打開髓腔取出牙髓稱重記錄。分別稱取3次，記錄平均值，并計算牙髓占牙齒比例。匯總結果，對不同年齡段牙髓占牙齒比例進行統計學分析。

1.4 掃描電鏡觀察

牙齒離體后立即用生理鹽水清洗，打開髓腔取出牙髓，10%中性福爾馬林液固定24 h；50%～100%乙醇系列脫水：50%乙醇30 min，60%乙醇30 min，70%乙醇30 min，80%乙醇30 min，90%乙醇30 min，100%乙醇3次，每次30 min，空氣干燥過夜；噴金鍍膜，掃描電鏡觀察牙髓表面超微形態。

1.5 組織學觀察

牙齒離體后生理鹽水清洗，10%中性福爾馬林液固定24 h；14%EDTA（pH7.0）脫鈣2～3個月，X線片證實牙齒組織脫鈣完全；50%～100%乙醇系列脫水（同前），之后浸入二甲苯2次，每次60 min；石蠟浸潤2次，每次60 min；石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE染色，觀察牙髓組織內成牙本質細胞層完整與否、細胞與纖維構成情況；阿爾新藍－希爾紅染色，偏振光顯微鏡觀察有無雙折射現象。

1.6 免疫組化染色

牙齒標本切片烘干，脫蠟，蒸餾水洗2次，2%辣根過氧化物酶作用20 min，PBS洗5 min，高壓鍋法暴露抗原，5%羊血清封閉20 min，PBS洗5 min，加入一抗STRO-1(1∶200)，DSP（1∶400）孵育1 h，PBS洗5 min，采用EnVision System。EnVision A液30 min，PBS洗5 min，EnVision B+C液5 min，觀察顯色反應。清水沖洗，蘇木素復染2 min，DPX封片，顯微鏡下觀察STRO-1及DSP表達情況。

2 結果

2.1 牙髓占牙齒比例

不同年齡段牙髓占牙齒比例由1.056%～4.826%不等，其中11～20歲第三磨牙牙髓占牙齒比例最高，為（4.826±0.017）%；50歲以上年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例最低，為（1.056±0.044）%。對不同年齡段前磨牙及第三磨牙分組進行統計學分析結果顯示，11～20歲與21～30歲年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＞0.05；11～20歲與31歲之后的各年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例相比，P＜0.001；11～20歲與21～30歲第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.01；11～20歲與31歲之后的各年齡段第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.001。隨著年齡的增加，牙髓占牙齒比例逐漸減少，但是40～50歲與50歲以上前磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＞0.05，40～50歲與 50歲以上第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.05（圖1）。

2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察可見，部分牙髓類似樹樁，有些區域比較平滑，有些區域表面有不規則突起，可能是成牙本質細胞突起的近髓斷端；還可以觀察到細長的管狀結構疑似牙髓細小分支（圖2）。

2.3 牙髓組織學觀察

HE染色可見冠部牙髓殘留成牙本質細胞，但是成牙本質細胞突起不完全（圖3）。冠方牙髓組織中細胞成分較多，纖維成分較少；根部牙髓組織中細胞成分較少，纖維成分較多。阿爾新藍－希爾紅染色示牙本質呈紅色，成牙本質細胞層及部分牙髓組織呈藍色，部分牙髓呈纖維結構，呈紅色。偏振光顯微鏡可見牙本質及部分牙髓呈雙折射現象（圖4）。

圖1 不同年齡段前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒比例（＊＊：P＜0.01；＊＊＊：P＜0.001）Fig.1 Dental pulp/tooth ratio of premolars and third molars from different age groups(**:P＜0.01;***:P＜0.001)

圖2 掃描電鏡下摘除的牙髓表面形態（標尺：200 μm）Fig.2 The surface morphology of the extracted dental pulp tissue(scale bar:200 μm)

圖3 冠方及根部牙髓組織（HE染色，200×）Fig.3 Coronal and radical pulp tissues(HE staining,200×)

圖4 牙髓組織偏振光顯微鏡下觀察(阿爾新藍-希爾紅染色，200×)Fig.3 Dental pulp tissue observation under the polarized light microscope(Alcian blue/Sirus red staining,200×)

2.4 牙髓干細胞的分布

STRO-1陽性表達細胞在牙髓組織中散在分布，在血管周圍較密集，提示近血管周圍存在較多的干細胞。DSP表達則主要集中在牙本質區域及成牙本質細胞內，牙髓內僅有少量表達（圖5）。

3 討論

牙髓位于由牙本質圍成的牙髓腔內，由細胞、細胞間質和細胞間液組成。牙髓的細胞成分包括成牙本質細胞、成纖維細胞和防御細胞等。2000年，Gronthos等[5]首次體外成功分離培養了人牙髓干細胞，提示牙髓組織中還存在保持未分化狀態的成體干細胞，這些細胞具有高度增殖分化潛能。相對于胚胎干細胞的研究，成體干細胞研究不涉及相關倫理問題及取材限制等，可以取自患者，經誘導分化后再移植回患者體內，不存在免疫排斥問題[6-8]。因此，成體干細胞的研究具有廣闊前景。但是，隨著供體年齡的增長，成體干細胞是否存在數量及活性上的變化，是否影響到將來臨床應用的效果，這些問題都有待進一步研究。本實驗收集了門診因正畸或其他原因拔除的健康前磨牙及第三磨牙，并按照年齡段分組，統計結果顯示，50歲以上年齡段牙髓占牙齒比例很小，這可能是因為隨著年齡增長，繼發性牙本質不斷形成，牙髓腔逐漸變小。該結果提示取年輕患者的牙齒供體可以獲得較多的牙髓組織。

在許多組織中，成體干細胞與組織前體細胞常常難以區分。多數學者認為，在牙髓組織中，成體干細胞，即牙髓干細胞，可以生成該組織所有的分化細胞類型，包括成牙本質細胞、神經元細胞、防御細胞等；而前體細胞只能分化成特定的功能細胞[9]。目前的技術手段還不能準確地鑒別成體干細胞和前體細胞。形態學上，牙髓干細胞比較小，有不明顯的胞漿突，通常位于小血管及毛細血管周圍[10]。在牙髓干細胞的研究過程中，STRO-1常被視為牙髓干細胞未分化的標記物，而DSP常常作為成牙本質細胞分化的特異分子標記物[11-14]。有研究結果表明，在未經誘導的牙髓干細胞中，DSP只有少量弱陽性表達，誘導其向成牙本質細胞方向分化以后，可以出現陽性表達[15]。D’Souza等[16]證實，DSP出現于牙本質礦化前的年輕成牙本質細胞中，與早期分泌的前期牙本質伴隨出現；DSP在成熟的前期牙本質中表達增多，而在牙本質形成過程中，牙髓基質以及其他組織和細胞中則不表達。盡管近些年來有些學者在骨、軟骨等組織提取物中檢測到DSP的存在，表明這些組織中也有少量的DSP表達，但是表達水平與在牙本質中相比是極其微量的[17-19]。因此，目前仍然將DSP作為成牙本質細胞特異性標記物來進行相關檢測。本實驗中，STRO-1表達陽性的細胞主要集中在牙髓組織血管周圍；而DSP表達陽性的細胞主要是成牙本質細胞，以及近成牙本質細胞層區域的牙髓組織。STRO-1陽性細胞不表達DSP，而DSP陽性細胞不表達STRO-1，這一結果也驗證了STRO-1表達陽性代表的牙髓干細胞與DSP表達陽性代表的成牙本質細胞或成牙本質前體細胞在牙髓組織中的分布情況。

對牙髓干細胞在牙髓組織中的分布一直存在著不同的認識，有研究比較了人牙冠髓與根髓培養細胞的特性，從培養成功率、細胞貼壁率、細胞活性、增殖特性、細胞形態以及細胞誘導礦化能力等多方面探討了牙髓干細胞在牙髓組織中的定位。結果發現，培養的根髓細胞相比冠髓細胞具有較高的成功率及貼壁率，較強的細胞活性，以及相同的增殖活性；根髓細胞相比冠髓細胞，形態更具有原始性，更易誘導礦化[9]。本實驗發現冠髓細胞排列疏松錯落，根髓細胞排列條理有序，在組織形態上顯示出差異。冠髓殘留有成牙本質細胞，但是該成牙本質細胞不完全，細長的成牙本質細胞突起部分缺失，通過掃描電鏡及組織學染色先后得到證實。牙髓某些區域偏振光顯微鏡下呈現雙折射現象，而某些區域則沒有雙折射現象，提示牙髓組織結構性質不均一。今后需要繼續深入研究牙髓組織結構特點以及細胞的功能與活性。

本實驗通過檢測STRO-1及DSP在牙髓組織內的表達，為牙齒組織工程供體研究提供了牙髓組織及牙髓干細胞分布等相關信息，為供體選擇提供了一定的依據，具有積極的理論意義和潛在的臨床參考價值。

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Experimental Study on Dental Pulp Tissue Proportion and Stem Cell Distribution of Dental Pulp Tissue in Different Age Groups

ZOU Huiru1,2,YANG Xuebin2,Steven Brookes2,QIN Zongchang1,YANG Min1,HE Shuping1,XIN Yu1, ZHANG Lancheng1.1 Tianjin Stomatological Hospital,Nankai University,Tianjin 300041,China;2.Leeds Dental Institute, University of Leeds,Leeds LS2 9LU,UK.Corresponding author:ZHANG Lancheng(E-mail:lenchong_zhong@sina.com.cn).

Objective To investigate the pulp/tooth ratio and distribution of stem cells of dental pulp tissue in premolars and third molars from different age groups and assess the selection of clinical specimens for dental tissue engineering. Methods Healthy premolars and third molars of different ages were collected during removal due to orthodontic or other reasons.Both the teeth and pulp tissues were weighed and dental pulp/tooth ratio were calculated.The surface morphology of the extracted dental pulp tissue was observed under SEM.After fixed and decalcified,premolars and third molars were embedded and cut for HE staining.Then the slides were observed under the microscope to check the integrity of odontoblast cell layer and the cell/fiber distribution.Alcian blue/Sirus red staining was used and slides were observed under the polarized light microscope to check birefringence.Immunohistochemical staining was used to observe specific mesenchymal stem cell markers STRO-1 and dentin sialoprotein-DSP expression to assess the distribution of dental pulp stem cells in dental pulp tissue.Results The pulp/tooth ratio was gradually reduced with age.SEM showed the “stump-like”pulp tissue with relatively smooth in some regions and irregular protrusions in other regions.There were birefringence in the pulp tissue. STRO-1 positive cells were scattered in dental pulp tissue,and concentrated around blood vessels.DSP expression was mainly concentrated in the region of dentin and odontoblasts.Conclusion The pulp tissue shrinks with age.Dental pulpstem cells are scattered in the pulp tissue and distributed mainly around the blood vessels.Undifferentiated dental pulp stem cells do not express odontoblast-related.

Human dental pulp tissue;Dental pulp stem cells;Distribution;STRO-1;Dentin sialoprotein

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）06－0306－05

2011年9月5日；

2011年10月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.06.002

300041 天津市 南開大學附屬口腔醫院，天津市口腔醫院（鄒慧儒，秦宗長，楊敏，何淑萍，辛宇，張蘭成）；Leeds Dental Institute,University of Leeds,Leeds LS2 9LU,UK.（利茲大學口腔研究所）（鄒慧儒，YANG Xuebin，Steven Brookes）。

張蘭成（E-mail：lenchong_zhong@sina.com.cn）。