胃泌素對大鼠胃黏膜的影響

陶琴琴 周麗雅 鄧 凱 李 淵 林三仁 楊燕琳 黃 琛 陳 櫟

(北京大學第三醫院消化科,北京 100191)

在胃腸道激素參與消化系統疾病發生與發展的研究中,胃泌素(gastrin,GAS)尤為引人注目,隨著對腫瘤分子生物學的不斷研究,在胃癌[1]、大腸癌[2]、胰腺癌[3]以及小細胞肺癌[4]等腫瘤組織中均觀察到有胃泌素基因的表達,在癌組織和癌旁組織中胃泌素受體陽性表達率也明顯高于正常組織,提示胃泌素可作為腫瘤臨床診斷與預后的一項參考指標。Michael等[5]指出胃癌患者血清胃泌素水平明顯升高,腫瘤經手術切除后,血清胃泌素明顯下降,術后當腫瘤復發時胃泌素水平又再次升高,提示胃泌素的升高可能是胃癌癌前病變的一種征象,可作為鑒別胃良惡性疾病的一個較好的生物學標志物。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染與消化道腫瘤形成的關系正受到人們的重視,Robertson等[6]認為可能與其誘導的胃泌素水平升高有關。因此,對胃泌素的研究,有助于臨床上對患者采取合理的治療方式。本研究通過單獨的胃泌素刺激W istar大鼠,探索胃泌素對大鼠胃黏膜的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

胃泌素(注射用)購于 Sigma公司,為白色粉末,使用前用二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為 0.2 μg/μl的溶液。小鼠抗大鼠多克隆胃泌素抗體購于中山金橋公司,兔抗大鼠多克隆組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)抗體購于 America Research Product公司,這兩種抗體在使用前分別用抗體稀釋液配成所需濃度。二抗鼠/兔通用型抗體和 DAB(二氨基聯苯胺或聯苯二胺,3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride)顯色液均購于Dako公司。

1.2 實驗動物及分組

健康雄性 Wistar大鼠 60只,4周齡,體重 70 g左右,北京維通利華實驗動物中心提供[合格證號：SCXK(京)2006-0008],飼養于北京大學醫學部的實驗動物中心。所有動物隨機分為 2組,空白對照組 22只,不加任何處理因素,自由飲用純凈水;胃泌素組 38只,連續每天每只皮下注射胃泌素 300 μg/kg,共 30天,自由飲用純凈水。

1.3 動物標本取材和染色

實驗第 12周開始取材,每隔 4周取材一次,共觀察 56周?？瞻讓φ战M每次處死 2只(第 54周和第 56周由于動物只數有限各處死了 1只),胃泌素組每次處死 3只。禁食 24小時,2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,取出大鼠胃,沿胃大彎切開,用生理鹽水把胃表面充分清洗干凈,然后肉眼觀察胃黏膜大體形態變化,每只動物在胃體和胃竇分別取材2塊,隨后將組織固定于 10%中性福爾馬林溶液中,經石蠟包埋、切片(厚度 5μm),進行蘇木精 -伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,觀察胃黏膜的組織病理學變化,并且在 10倍光學顯微鏡下,每張切片隨機取 10個視野,測量胃泌酸區黏膜層的厚度,取平均值(mm)。

1.4 大鼠胃組織免疫組織化學染色

上述石蠟切片,分別做胃泌素抗體(1∶100)和HDC抗體(1∶400)的免疫組化染色,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)代替一抗作為陰性對照,用公司提供的陽性反應組織作為陽性對照。具體步驟參照操作說明書進行。結果判定標準：凡胞漿中出現明顯的棕黃色顆粒為蛋白陽性細胞。每張切片隨機觀察 10個高倍視野進行細胞計數分析,將上述免疫組化結果用 Image-Pro-Plus6.0圖像分析軟件進行圖像分析,細胞計數。

2 結果

2.1 兩組大鼠胃組織 HE染色情況

見圖1、2?？瞻讓φ战M動物胃未見明顯異常,且胃黏膜層厚度處于相對平穩的狀態。胃泌素組動物胃黏膜層出現腺體的單純增生,厚度增加。

2.2 胃泌素抗體和 HDC抗體在兩組胃組織中表達的比較見圖3～5?？瞻讓φ战M胃組織中胃泌素抗體和 HDC抗體的表達始終處于相對平穩的狀態。隨著實驗時間的延長,胃泌素組胃組織中胃泌素抗體的表達雖然逐漸下降,但其表達一直處于相對較高水平狀態,而 HDC抗體的表達呈逐漸上升,然后趨于平穩。

3 討論

胃泌素由分布于胃竇和十二指腸近端的 G細胞分泌,與腸嗜鉻樣細胞(enterochromaffin-like cell,ECL)上特異受體即膽囊收縮素 B(cholecystokinin-B,CCK-B)結合后,作用于組胺酸脫羧酶,刺激 ECL細胞合成和釋放組胺,介導對壁細胞胃酸分泌的調節[7]。同時胃泌素亦作為一種營養性胃腸道激素,不僅刺激正常胃腸道黏膜組織的生長,還能通過與其受體介導的細胞內信號傳導途徑刺激 ECL細胞過度增殖,刺激胃癌、大腸癌等腫瘤細胞的生長[8]。

本研究結果顯示：胃泌素組動物出現了腺體的單純增生,黏膜層增厚,黏膜快速增厚期為前 24周。盡管本實驗胃泌素只連續使用了 30天,但是增厚的胃黏膜在停止了外源性胃泌素的刺激后,在觀察的56周內增厚的胃黏膜也沒有恢復到正常。對高胃泌素血癥的Zollinger-Ellison綜合征患者進行結腸鏡檢查和細胞增殖動力學的研究[9],結果表明長期高胃泌素血癥可以促進腸道黏膜過度增生而發生癌變。在癌旁組織中胃泌素陽性表達率明顯高于正常組織[10]。癌旁組織中雖然沒有明顯的組織形態學改變,但是胃泌素的表達已經增高,提示此處組織可能已經處于癌前病變狀態,在需要實行手術切除腫瘤治療時,在切除范圍允許的條件下,其遠端的切緣應盡可能地遠離癌變組織[11]。Kawase等[12]在雄性棉鼠中單獨使用 H2受體拮抗劑 loxtidine(即拉伏替丁),造成棉鼠的高胃泌素血癥,6個月后 4/5只棉鼠泌酸黏膜出現不規則增厚和胃的重量增加,發生了胃癌。但是本實驗沒有誘導出胃癌,可能與胃泌素只使用了 30天,使用的時間過短有一定關系,動物的飼養方式、給藥方式和藥物劑量等均可能導致出現不同的誘癌效果,因此單獨使用胃泌素能否引起胃癌發生的研究還有待于進一步深入的探討。

圖1 兩組大鼠胃體 HE染色圖(×100)A.空白對照組;B.胃泌素組?？梢娢该谒亟M腺體單純增生,胃黏膜層增厚

圖2 兩組大鼠胃泌酸區黏膜層的厚度

為了進一步探討胃黏膜層增厚的可能機制,本研究采用免疫組化方法對兩組胃組織標本進行分析處理。胃泌素抗體作為 G細胞的標記物,HDC是ECL細胞合成組胺所必需的酶,可以作為 ECL細胞的標記物。與空白對照組相比,胃泌素組動物胃泌素抗體和 HDC抗體的表達均升高,提示胃泌素水平升高后,與 ECL細胞上特異性 CCK-B受體結合,刺激 ECL細胞增殖及生長分化,這與既往的研究結論相一致。胃泌素升高后,刺激 ECL細胞的過度增殖是胃泌素促進胃黏膜增厚的可能機制之一。長期使用質子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)的患者,高胃泌素血癥導致胃黏膜 ECL細胞增生的現象也比較常見,甚至可以出現 ECL細胞微小結節樣增生,連續的組織學觀察顯示,高胃泌素血癥刺激 ECL細胞發生增生以后,即使停用PPIs,不但高胃泌素血癥難以恢復,ECL細胞增生也不會恢復,這兩者可以互相促進,互為因果[13]。合并 Hp感染的服藥患者,由于疊加的影響,隨著高胃泌素的加重,胃黏膜ECL細胞增生的現象更為明顯[14]。

圖3 胃泌素抗體和 HDC抗體免疫組化圖(×400),兩種抗體陽性反應物主要位于胞漿,呈棕黃色顆粒,經蘇木素復染后胞核呈藍色。A.空白對照組胃竇胃泌素抗體;B.胃泌素組胃竇胃泌素抗體;C.空白對照組胃體 HDC抗體;D.胃泌素組胃體HDC抗體。胃泌素組大鼠不同胃組織中胃泌素抗體和 HDC抗體的表達均高于空白對照組

目前臨床上常用的 H2受體拮抗劑和 PPIs類藥物均可能在抑酸的同時導致胃泌素水平升高,胃食管反流病發生率的升高也會使這兩類藥物的使用有所增加。而且中國又是一個 Hp感染高發的國家,Hp的感染又會進一步使胃泌素升高。胃泌素水平升高后,可以引起 ECL細胞的過度增殖,黏膜層增厚,且有潛在的誘發胃腸道腫瘤的作用。因此,在使用這些藥物之前是否需要根除 Hp,而且在使用這些藥物期間是否需要進行隨訪及藥物的使用期限等,均是需要我們解決的問題。分子生物學技術的發展,將會加快對胃泌素及其受體研究的深入,將有助于揭示消化道腫瘤的發病機制,為臨床設計受體激動劑和拮抗劑奠定基礎。胃泌素及其受體拮抗劑的研究將為消化道腫瘤的內分泌治療開辟新的途徑。

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