不同嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(DY15, DY26, DC)對黃銅礦的浸出及其基因Afe0022的差異表達

吳學玲，袁 鵬，胡 琪，侯冬梅，苗 博，邱冠周

(1. 中南大學 資源加工與生物工程學院，長沙 410083；2. 中南大學 教育部生物冶金重點實驗室，長沙 410083)

不同嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(DY15, DY26, DC)對黃銅礦的浸出及其基因Afe0022的差異表達

吳學玲1,2，袁 鵬1,2，胡 琪1,2，侯冬梅1,2，苗 博1,2，邱冠周1,2

(1. 中南大學 資源加工與生物工程學院，長沙 410083；2. 中南大學 教育部生物冶金重點實驗室，長沙 410083)

通過搖瓶浸礦比較研究3株Acidithiobacillus ferrooxidans (At. ferrooxidans)菌DY15、DY26和DC的耐受Cu2+能力的差異以及在不同的初始Cu2+濃度影響下菌對黃銅礦浸出能力的不同。采用Real time RT(Reverse transcriptase) PCR檢測這些菌株的陽離子通道蛋白基因Afe0022在不同Cu2+環境下的差異表達，進行相對表達量分析。結果表明：DY15、DY26和DC菌的最高Cu2+抗性分別是0.40、0.22和0.04 mol/L，且在以元素硫為能源的9K培養基中，3株菌DY15，DY26和DC對應的培養體系pH值在7 d內由1.8分別降到0.8、1.2和1.3，說明DY15的硫氧化能力最強；3株菌都具有較好的亞鐵氧化能力，在40 h內，DY15、DY26和DC的Fe2+氧化率分別是80%、100%、100%。黃銅礦精礦浸礦實驗表明，DY15對黃銅礦精礦的浸出效率最高，DY26的其次，DC的最低，但DY15的單菌浸出效率略低于3株菌的混合浸出效率。對Cu2+抗性越強的菌株，其基因Afe0022表達量越高，這對菌株的Cu2+抗性能力有一定的理論解釋作用，在分子層面上為研究At. ferrooxidans菌抗銅機理提供一定的理論依據。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；黃銅礦精礦浸出；元素硫氧化；Cu2+抗性；差異表達

Acidithiobacillus ferrooxidans是一種嗜酸性的革蘭氏陰性菌，它能夠氧化Fe2+、元素硫以及還原無機硫化合物來獲取能量，在生物冶金領域受到廣泛的應用和深入的研究[1?4]。生物冶金通過黃銅礦和次生銅硫化物的氧化提取金屬，是從低品位礦石中獲取金屬的經濟有效的方法[5?7]。一些研究得分析了它的流程及機制,為進一步研究生物冶金的分子機制起到了理論和實踐指導作用[8?10]。

在生物浸出過程中，一些重金屬離子在高濃度時對細菌是有害的[11]。黃銅礦生物浸出的主要產物是Cu2+，當Cu2+濃度比較低時，它對細胞是低害或者無害的，但是當濃度上升后，這些離子就會抑制細菌的活性，進而影響浸出過程。因此，關于菌株浸出黃銅礦的能力大小與菌株耐受Cu2+的能力大小是否相關的研究至關重要。篩選出既具有較高的浸出效率同時又具有較高抗Cu2+能力的菌株是生物浸出成功的關鍵[12]。本研究針對具有不同Cu2+抗性的3株At. ferrooxidans菌株展開，測定它們的最高Cu2+耐受水平及Fe2+和元素硫的氧化能力，并對其黃銅礦精礦的浸出能力進行了分析比較，并就初始Cu2+濃度對細菌浸礦的影響進行了研究，以探究不同銅離子抗性的At. Ferrooxidans的Fe2+和元素硫的氧化能力及黃銅礦浸礦能力的差異。為了進一步探究At. ferrooxidans菌的抗銅機理，采用Real time RT-PCR法檢測不同菌株在不同Cu2+濃度下的Afe0022 的mRNA差異表達。

1 實驗

1.1 菌株

1.1.1 菌種資源和生長條件

本研究中的3個菌株分別來自廣西大廠銅礦山(DC)、湖北大冶銅礦山(DY15、DY26)。

1.1.2 菌株的培養，Fe2+和元素硫的氧化測定

培養基(9K基本培養基)：(NH4)2SO43.0 g/L, KCl 0.1 g/L, K2HPO40.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L,Ca(NO3)20.01 g/L，FeSO4·7H2O 20 g/L，pH 2.0，初始菌濃度為0.5×107cell/mL，利用直接細胞計數法做出生長曲線。利用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)滴定法對培養基中Fe2+濃度進行分析。1 mL 6 mmol/L的K2Cr2O7(1.8 mg)可以與2 mg Fe2+起反應。二苯磺酸鈉用作指示劑，當出現紫色時即為滴定的終點。由此測出菌株對Fe2+的氧化能力。在進行元素硫氧化能力測定時，培養基為無FeSO4·7H2O的9K培養基，加入10 g/L的元素硫做為能源，繪制生長曲線，用pH值的變化來監控元素硫的氧化。

為了進一步確定不同菌株的Cu2+抗性，基于一定預實驗的基礎，在不同Cu2+濃度(0.02～0.42 mol/L)的9K培養基中于160 r/min 30 ℃恒溫狀態下對三株菌進行培養[13?14]。利用重鉻酸鉀滴定法(K2Cr2O7)測定培養基中的Fe2+濃度，若培養體系中Cu2+濃度超過菌株的耐受能力，則Fe2+不會被氧化。

1.2 黃銅礦精礦的生物浸出

1.2.1 黃銅礦精礦樣品

本實驗使用的黃銅礦精礦為廣西德興銅礦的0.125 mm粒徑的礦粒，其化學組成見表1。

表1 黃銅礦精礦的主要成分Table 1 Main components of chalcopyrite concentrate (mass fraction, %)

1.2.2 黃銅礦精礦的生物浸出

利用搖瓶實驗浸出黃銅礦精礦，無鐵9K培養基加入150 g/L的黃銅礦精礦作為能源，初始菌濃度為1.0×107cell/mL[15?16]。為了評估浸礦過程中初始Cu2+濃度的影響，在該浸礦體系中分別加入不同初始濃度(0、0.001和0.05 mol/L)的Cu2+，160 r/min 30 ℃培養。在浸出過程中維持pH值在2.0。利用光學顯微鏡對浸出體系中的細菌進行計數。在36 d的培養周期內利用原子吸收光譜AA?6800每6 d測定一次浸出液中的Cu2+濃度。同時進行無菌空白對照實驗，所有的實驗同時設定3組平行實驗。

1.3 Real-time RT-PCR

將3株菌分別接種于含有不同濃度Cu2+的9K培養基中，并使接種后的菌濃度保持一致，分別培養至對數生長初期(Fe2+氧化率為20%)，經4 ℃離心(12 000 r/min)分離10 min，收集菌種，并立即提取細菌總RNA。

用TRIzol試劑(Invitrogen)提取總RNA，用RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen)純化RNA，RNase-free DNase set 試劑盒(Qiagen)去掉基因組DNA的污染，使用反轉錄試劑盒(Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit，MBI) 合成cDNA。

使用MyiQTM single color Real-time PCR Detection systerm (BIO-Rad)和SYBR Green Realtime PCR MasterMix試劑盒(QPK?201，YOBO Co.Ltd.)，鑒定目標基因在不同Cu2+濃度環境下的差異表達。以持家基因rrs (16s rDNA)為參照基因。實時定量(Real-time)PCR數據由Optical system software(Version 1.0)收集并處理。

2 結果與討論

2.1 銅抗性菌的抗性能力測定

菌株DY15、DY26 和 DC對Cu2+最高抗性分別為0.40、0.22和0.04 mol/L(見圖1)。顯然，這3種菌在Cu2+抗性上有很大的差異，DY15的Cu2+抗性最強，DC的Cu2+抗性最弱，抗性曲線也顯示菌株在不同Cu2+濃度下的生長情況，同時也可以看出，Cu2+的抑制作用主要是延長了菌株剛開始適應生長環境的時間，并提高了菌濃度。

2.2 株菌的生長和對Fe2+及元素硫的氧化能力Fe2+

DY15、DY26和DC在以元素硫為能源的9K培養基中，7 d內菌數由0.5×107cell/mL分別增加至1.1×108，1.0×108和1.0×107cell/mL，同時pH值由1.8分別降至0.8、1.2、1.3(見圖2(a)和(b))，顯然DY15的硫氧化能力最強，DY26居中，DC最低。

當Fe2+作為能源物質時，在40 h內，DY15、DY26和DC和的菌濃度從0.5×107cell/mL分別上升至3.25×107cell/mL、4.75×107cell/mL和5.25×107cell/mL(見圖2(c))。經過40 h，DY15、DY26和DC的Fe2+氧化率分別是80%、100%和100%。說明當Fe2+作為能源物質時，DY15的細菌生長能力及對Fe2+氧化能力最弱。比較這3株菌，不難發現DY15的Cu2+抗性最強，元素硫氧化能力最強，但Fe2+氧化能力最弱。而DC的Fe2+氧化能力最強，但Cu2+抗性及元素硫氧化能力均最弱(見圖2(c)和(d))，這為進一步的實際應用提供了一定的參考依據，根據不同的環境，應選擇不同的菌株，以達到在浸礦過程中的菌株濃度最高，并且菌株的活性最高，從而使得礦的浸出效果最佳。

2.3 黃銅礦精礦浸出

2.3.1 菌株在浸礦體系中的生長

據有關文獻報道，浸礦36 d時，浸出液中Cu2+約為0.001 mol/L[17]；由于菌株DC對Cu2+的最高耐受能力為0.04 mol/L，所以浸礦體系的初始Cu2+濃度設置為0、0.001和0.05 mol/L 3個濃度梯度，浸礦周期為36 d。

圖1 不同Cu2+濃度下的Fe2+氧化曲線Fig.1 Oxidation curves of Fe2+ at different initial Cu2+concentrations: (a) 0.40 mol/L, DY15; (b) 0.22 mol/L, DY26;(c) 0.04 mol/L, DC

圖2 不同能源物質時的生長和元素硫氧化曲線Fig.2 Growth(a) and sulfur oxidation(b) of 3 strains in 9K medium with different energy resources: (a), (b) Sulfur; (c), (d)FeSO4·7H2O

圖3 不同初始Cu2+濃度時浸礦菌在浸礦體系中的生長曲線Fig.3 Growth curves of bacteria in leaching system at different initial Cu2+concentrations: (a) 0; (b) 0.001 mol/L;(c) 0.05 mol/L

在浸礦過程的第一周，3株菌的菌濃度均從1.0×107cell/mL降至0.4×107cell/mL(見圖3)，說明此時細菌還不適應新的浸礦環境，細菌生長緩慢并有部分細菌死亡。在第二周，3株菌逐漸適應浸礦環境，開始進入指數生長期。經過36 d的浸礦，菌的濃度都有明顯上升，但每株菌浸礦效率明顯不同，也說明了菌株對浸礦體系的適應程度不同。初始Cu2+濃度為0時，浸礦體系中菌株DY15、DY26和DC的菌濃度從1.0×107cell/mL分別上升至1.1×108cell/mL，8.0×107cell/mL和5.0×107cell/mL(見圖3(a))。顯然，DY15在浸礦體系中菌濃度最高。同時，在以元素硫作為能源物質的9K培養基中，DY15的菌濃度也是最高，達1.1×108cell/mL(見圖2(a))，但在Fe2+作為能源物時，它的最高菌濃度只有3.5×107cell/mL(見圖2(c))，說明DY15能夠高效氧化元素硫并獲得能量，在黃銅礦精礦作為能源物質時也能夠很好地生長，浸礦菌對不同的浸礦環境會表現出極大的差異性。

在Cu2+初始濃度為0.001 mol/L時，DY15的最高菌濃度為1.0×108cell/mL，也高于DY26(7.75×107cell/mL)和DC(4.75×107cell/mL)(見圖3(b))，說明DY15的生長能力仍然最高，但此濃度的Cu2+對3株菌已有一定的抑制，3株菌的濃度都要低于初始Cu2+濃度為0時的菌濃度。當Cu2+初始濃度上升至0.05 mol/L時, 3株菌的生長受到明顯抑制，由于0.05 mol/L的Cu2+濃度高于DC的最高耐受能力(0.04 mol/L)，在此環境下DC不能生長。DY26菌濃度為5.6×107cell/mL，DY15菌濃度仍然最高(6.0×107cell/mL)(見圖3(c))。顯示了DY15在實際浸礦中一定的優越性，即使浸礦體系中的Cu2+濃度較高，也可以延遲從浸礦液中提取銅的時間，這將減少實際浸礦中頻繁提取銅帶來的成本，具有一定的實際應用價值。

2.3.2 3株菌在不同起始Cu2+濃度時黃銅礦精礦浸出

在浸出的前6 d，由于菌株還沒適應新浸礦環境而導致菌濃度很低，所以黃銅礦的浸出效率很低(見圖4，其中Mix代表3株菌的混合浸礦)。隨后，菌株進入對數生長期，浸礦效率也隨之升高。當初始Cu2+濃度為0.001 mol/L時, 它對3株菌的抑制比較弱(見圖4(b))，浸礦結束后，浸礦體系中浸出的Cu2+濃度(減初始Cu2+)分別為2.926 g (DY15)、2.432 g (DY26) 和2.436 g (DC)，這跟初始Cu2+濃度為0時的浸出相似(見圖4(a))。說明了低濃度的Cu2+(0到0.001 mol/L)對3株菌的浸礦能力無影響。

當初始Cu2+濃度為0.05 mol/L時(見圖4(c))，3株菌的浸礦效率都較低，細菌的生長受到抑制(見圖3(c))，導致在此環境下浸礦能力的下降。在此條件下，DY15的浸礦效率仍然高于DY26和DC的。但同時含有以上3株菌的混合浸礦效率要高于DY15純菌浸礦的效率。

黃銅礦精礦可能受到Fe3+和質子的攻擊而溶解，方程式如下：

圖4 不同初始Cu2+濃度時Cu2+的浸出曲線Fig.4 Cu2+ leaching curves in leaching system at different initial Cu2+ concentrations: (a) 0; (b) 0.001 mol/L; (c) 0.05 mol/L

嗜酸亞鐵氧化硫桿菌(At. ferrooxidans)通過氧化Fe2+、S和還原性硫化物來獲得能量。在浸礦中，黃銅礦是唯一的能源物質。因此，菌株的Cu2+耐受能力、硫氧化能力與黃銅礦精礦的浸出效果直接相關。通過圖4(a)和(b)可發現，在單菌浸礦中，DY15的浸出效率最高。一般而言，黃銅礦浸出效率主要依賴于菌種各項生理特征，包括菌的生長速率、重金屬抗性、對Fe2+和元素硫以及還原性硫化物的氧化能力等。在浸礦過程中，DY15能夠如上述方程式描述的那樣使黃銅礦精礦溶解，就是能夠耐受一定濃度的Cu2+并能氧化元素硫及其還原性氧化物。但是當浸礦體系的Cu2+初始濃度很高時(0.05 mol/L)(見圖4(c))，浸礦能力最強的DY15也受到一定的抑制。而在混合培養液中，DY26的硫氧化能力雖然低于DY15的，但其對Fe2+的氧化能力較強，所以，混合菌浸礦效率要高于單菌浸礦效率的原因，很可能是DY15和DY26的協同作用[18]，各株菌都有一定的浸礦優勢，并在混合浸礦中，每種菌都將優勢得以發揮，所以一般來說，混合浸礦的效果要優于純菌浸礦的。

2.4 不同Cu2+環境中3株菌抗銅基因Afe0022的差異表達

菌株DC、DY26和DY15在不同濃度Cu2+脅迫下抗銅基因Afe0022的表達上調倍數如表2所列。

在Cu2+作用時，只要尚未達到菌株最高耐受Cu2+濃度，基因Afe0022的表達都上調，DC、DY26和DY15菌在各自最高Cu2+脅迫時的抗銅基因Afe0022 表達量相對于無Cu2+脅迫情況下的上調倍數分別為18.31、55.53和186.22，這說明培養體系中Cu2+對細菌的抗銅基因Afe0022的表達具有一定的刺激作用，DY15的抗性最強，故其抗銅基因Afe0022 表達量在最高耐受濃度時是3株菌中最高的，DC對Cu2+的抗性最弱，所以DC的抗銅基因表達量最低。且在菌株的最大Cu2+耐受范圍內，隨著Cu2+濃度的上升，抗銅基因Afe0022的表達量也上升。這也說明了菌株對Cu2+的抗性強弱，在一定程度上跟菌株自身抗銅基因Afe0022的表達量成正比關系。3株菌抗銅基因Afe0022對同一Cu2+濃度的敏感程度也不一樣，在Cu2+濃度為0.04 mol/L的時候，3株菌抗銅基因Afe0022的表達增加量分別是：DC為18.31倍，DY26為11.55倍，DY15為1.17倍。由此可以看出，對Cu2+抗性越強的菌株，其對Cu2+的敏感性越弱，也就是說，較低濃度的Cu2+還不足以促使高耐受Cu2+的菌株大量表達抗銅基因，但是對于不同菌株，一旦Cu2+濃度達到一定高度，那么菌株抗銅基因Afe0022的表達量就會迅速提升。當培養體系中Cu2+濃度超過菌株的最大耐受濃度時，菌株不能生長。

表2 不同Cu2+濃度環境下抗銅基因Afe0022 的差異表達Table 2 Difference expression of Afe0022 in At. ferrooxidans strain DC and DY26 under different Cu2+ concentrations

3 結論

1) 3株At. ferrooxidans DY15、DY26和DC有著不同的Cu2+耐受能力、元素硫氧化能力和Fe2+氧化能力。其對Cu2+的最大耐受濃度依次為 0.40 mol/L、0.22 mol/L和0.04 mol/L，對元素硫的氧化能力由大至小的順序依次為DY15、DY26和DC，對Fe2+的氧化能力由大至小的順序依次為DY15、DY26和DC。

2) 3株菌中DY15對Cu2+的耐受能力最強，對元素硫的氧化能力最強，在純菌浸礦過程中，在各種條件下DY15的生長速度均最快且浸礦效率最高，說明浸礦效率的高低與菌株的Cu2+耐受能力和元素硫的氧化能力密切相關。

3) 在浸礦過程中，當浸礦體系中起始Cu2+濃度很高時，DY15的生長速度及浸礦效率仍高于DY26和DC的，但略低于混合菌浸礦效率。這可能與其Fe2+的氧化能力較弱有關，并說明不同菌種之間的相互作用可有效提高浸礦效率。

4) 環境中Cu2+濃度只要尚未達到細菌最高耐受Cu2+濃度，抗銅基因Afe0022 的表達都上調，Cu2+濃度高的環境中比在Cu2+濃度低的環境中上調倍數更高，說明抗銅基因Afe0022 對Cu2+的脅迫是敏感的，且其表達量與菌株對Cu2+耐受能力的強弱成一定的正相關。

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Bioleaching of chalcopyrite by Acidithiobacillus ferrooxidans DY15,DY26 and DC and difference expressions of gene Afe0022

WU Xue-ling1,2, YUAN Peng1,2, HU Qi1,2, HOU Dong-mei1,2, MIAO Bo1,2, QIU Guan-zhou1,2

(1. School of Resources Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China;2. Key Laboratory of Biometallurgy, Ministry of Education, Central South University, Changsha 410083, China)

The effects of different initial concentrations of Cu2+on chalcopyrite concentrate bioleaching and the difference of ability in response to copper ion (Cu2+) were investigated with three strains of Acidithiobacillus ferrooxidans (At. ferrooxidans) DY15, DY26 and DC. The real time reverse transcriptase (RT) PCR was used to analyze the difference expression of gene Afe0022 cation channel protein in copper ion with different concentrations. The results show that strain DY15, DY26 and DC have the copper ion tolerance level of 0.40, 0.22 and 0.04 mol/L, respectively.When the elemental sulfur acts as the energy resource in 9K medium, the oxidation capacity of elemental sulfur of strain DY15 is better than that of elemental sulfur of DY26 and DC, and after 7 d, the pH values of DY15, DY26 and DC decline from 1.8 to 0.8, 1.2 and 1.3, respectively. All three strains can oxidize ferrous ions well, and after 40 h, the oxidation capacities of ferrous ions of three strains are 80% (DY15), 100% (DY26), and 100% (DC), respectively. In the leaching experiment, strain DY15 has the highest bioleaching efficiency on chalcopyrite concentrate while strain DC has the least bioleaching efficiency in the three strains, but the mixed cultures containing 3 strains exhibit the highest bioleaching efficiency than the pure cultures of DY15. The stronger the capacity of strain resistance to Cu2+is, the more the expression of gene Afe0022 is. This result assists interpretation of bacterium resistance to Cu2+, and provides theoretical basis to study the mechanism of bacterium resistance to Cu2+in molecular level.

Acidithiobacillus ferrooxidans; chalcopyrite concentrate bioleaching; sulfur oxidation; Cu2+resistance;difference expression

Q819

A

1004-0609(2011)04-0932-07

2010-02-01；

2010-09-06

吳學玲，副教授，博士；電話：0731-88804873；E-mail: xueling0714@yahoo.com.cn

(編輯 李艷紅)