20份馬蹄金種質資源遺傳多樣性RAPD和SRAP分析

付 薇，周玉鋒，干友民，王小利，張建波，

(1.貴州省草業研究所，貴州 貴陽 550006；2.四川農業大學草業科學系，四川 雅安 625014)

馬蹄金(Dichondrarepens)植株低矮，葉形美觀，成坪后無需修剪，管理成本低廉，用途多樣，在國外通常用作優良地被綠化材料或固土護坡植物，有很高的推廣利用價值[1]。國內許多學者對馬蹄金的生物學特征、栽培管理、生理生化等方面開展了相關的研究工作[2-5]，但在資源收集、鑒定與評價等方面鮮見報道，分子水平的研究更為少見。我國野生馬蹄金群落分布范圍較廣，受地形、地勢及氣候差異等多方面因素影響，各地的野生馬蹄金在形態及遺傳上都存在不同程度變異，是一種極具開發價值的地被植物種質資源四川農業大學干友民等廣泛收集四川、云南、貴州、重慶境內的野生馬蹄金種質資源，在國內首次對其遺傳多樣性、形態、生長習性、生產繁殖性能及繁殖技術、抗脅迫能力、景觀性能等方面進行評價與篩選，發現野生馬蹄金具有優良的綠化價值和生態特性，且各地區的材料在外部形態上和抗性方面存在較大的差異[6-9]。

隨著分子標記技術的不斷發展成熟，目前已有多種分子標記技術(RAPD、ISSR、SSR和SRAP)被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析[10-12]、遺傳連鎖圖譜構建[13-14]、基因定位[15]和比較基因組學研究[16]等方面。利用單一分子標記技術對馬蹄金種質遺傳多樣性進行研究會因為這種分子標記技術本身的局限而使結果不夠完整可靠。為此，本研究結合不同分子標記技術的自身特點，以1份美國進口品種為對照，采用RAPD和SRAP 兩種分子標記分別對來自四川、重慶、貴州、云南的20份野生馬蹄金和1份美國進口品種進行分子水平遺傳多樣性研究，以期探明馬蹄金的遺傳基礎及不同材料間的遺傳差異，獲得較為完整的遺傳分類及親緣關系資料，為馬蹄金種質資源保護和品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1供試材料 20份供試材料來自云南、四川、重慶、貴州等西南地區4省(市)，同時以1份美國普通馬蹄金(Common)為對照品種。全部資源保育于四川農業大學草業科學系資源圃內和貴州省草業研究所獨山基地。

1.2試驗方法

1.2.1馬蹄金DNA提取 采集新鮮幼嫩的馬蹄金葉片，采用廣州達暉生物技術公司生產的植物基因組提取試劑盒進行基因組DNA提取。以已知濃度的標準DNA與馬蹄金樣本DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，檢測DNA質量、濃度，并稀釋至10 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 試驗馬蹄金材料及采集地

1.2.2RAPD反應程序 參照張西西等[17]、田志宏等[18]的研究方法，從100個隨機引物(由北京賽百盛公司合成)中篩選出20個條帶清晰，多態性好的引物對馬蹄金DNA進行擴增，擴增體系如下：10×PCR buffer 2.5 μL，模板DNA 30 ng，Mg2+3.5 mmol·L-1，dNTP 300 μmol·L-1，引物0.4 μmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.0 U，總體積為20 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；前38個循環程序為94 ℃ 30 s，38 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴增結束后，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經0.1% 溴化乙錠染色后，凝膠成像系統照相。

1.2.3SRAP反應程序 參照Li和Quiros發表的引物[19]和袁學軍等的方法[20]，從80對引物(由上海捷瑞生工合成)中篩選出22對進行DNA擴增，優化后擴增體系如下：Mg2+2.5 mmol·L-1、dNTP 0.3 mmol·L-1、引物0.4 μmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA濃度10 ng·μL-1，總體積為20 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸，5個循環；94 ℃變性1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，37個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增結束后，上樣于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行分離，IXTBE緩沖液，電泳結束后快速銀染檢測。

1.3數據統計與分析 電泳結果數字化及多態性判斷，有多態帶記為1，無帶記為0，將所有材料的擴增條帶轉換為0，1矩陣后，采用NTSYS-pc軟件計算遺傳相似系數(GS)，GS=2Nij(Ni+Nj),式中，Ni為材料i的條帶數，Nj為材料j的條帶數，Nij為i和j中都出現的條帶數。原始數據的整理采用Excel軟件完成，利用NTSYS-pc 2.10軟件進行遺傳相似系數計算、UPGMA方法聚類。

2 結果與分析

2.1馬蹄金的RAPD和SRAP標記多態性分析 20份RAPD引物共擴增出189條帶，其中130條具有多態性，多態性條帶比率(PPB)為68.78%，擴增條帶變幅6～13條，每個隨機引物平均產生6.5條多態性條帶(表2、圖1)。多態性最高的引物是SB5，達到100%；多態性最低的引物是SB6，僅為30.00%。相比之與RAPD，22對SRAP引物共計擴增條帶242條，其中多態性條帶為175條，占總條帶的72.31%，引物組合Me5+Em4擴增條帶最多達14條，組合Me6+Em6和組合Me8+Em2擴增條帶最少，僅為7條，每對引物平均擴增出7.95條多態性條帶(表3)。引物組合Me5+Em9多態性高達到90.00%，組合Me8+Em9多態性最低，僅為58.33%。相比較而言，SRAP分子標記所檢測到的馬蹄金多態性略高于RAPD。

2.2馬蹄金親緣關系分析 利用NTSYS-pc軟件，對20個RAPD引物的擴增結果進行遺傳相似系數(Genetic Similarity,GS)計算。GS值變化范圍為0.323～0.984，平均值為0.665，遺傳距離在0.016～0.677，平均遺傳距離為0.335。GS最大值同時出現在兩組四川材料中，即材料SD200309與材料SD200310以及材料SD200308與材料SD200411之間，同為0.984；材料SD200303與材料SD200512遺傳相似系數最小，僅為0.323，表明二者之間親緣關系最遠。SRAP標記下，GS值的變化范圍在0.479～0.942之間，平均值為0.716，遺傳距離在0.058～0.521，平均遺傳距離為0.284。與RAPD結果不同，GS最大值出現在兩份云南材料YD200505和YD200506之間，為0.942；GS最小值則同時出現在兩份云南材料YD200504與YD200506，以及美國進口品種Common與云南材料YD200506之間，僅為為0.479。兩種分子標記方法所檢測到的馬蹄金親緣關系存在一定的差異。

2.3馬蹄金RAPD聚類分析 根據遺傳相似系數，21份供試馬蹄金被劃分為2個類群(圖3)。結合王昆蕾等[21-22]對馬蹄金形態特征的研究來看，聚類結果與其形態特征相關。第Ⅰ類群包括9份材料，這一類群種質葉片偏大，葉色深綠，除SD200303外，其他8份材料分枝能力較弱；SD200304、SD200303和CK在葉色、 葉片大小上都較為相似。第Ⅱ類群包括12份材料，這一類群種質葉片較第Ⅰ類小，葉色綠。

表2 20個RAPD引物對21份馬蹄金材料擴增結果

圖1 引物SC6對21份馬蹄金擴增的RAPD圖譜

表3 22對SRAP引物對21份馬蹄金材料的擴增結果

圖2 Me2+Em10引物組合的SRAP 擴增譜帶

2.4馬蹄金SRAP聚類分析 21份供試材料同樣被劃分為2個大類(圖4)，該聚類結果與筆者選用19份SRAP引物所得的聚類結果比較相似[23-24]。第Ⅰ類群由2份云南材料YD200503、YD200504、5份四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407、1份貴州材料GD200502以及美國品種Common組成。盡管美國品種與材料GD200502聚類結果較近，且同時劃分在第Ⅰ類群，但根據筆者區域試驗顯示[23]，Common這份材料綠色期、葉柄長度、抗性等多個坪用特性較之于其他材料有很大差異。第Ⅰ類群由2份云南材料YD200506、YD200505、8份四川材料SD200302、SD200309、SD200512、SD200406、SD200513、SD200310、SD200308、SD200411 和2份貴州材料GD200504、GD200503組成，該類群材料葉片較小，葉柄較短，葉色綠，綠期較長。由此可見，22份馬蹄金材料中，除了貴州材料GD200502和美國進口品種Common的聚類沒有明顯的聯系外，來自相似生態環境的材料能大致聚在一起，且聚類結果與形態學特征、坪用特性也表現出一定相關性。

2.5RAPD和SRAP相關性分析 本研究用篩選出的20個RAPD引物和22對SRAP引物組合對21份馬蹄金材料進行PCR擴增，RAPD擴增結果的GS值在0.323～0.984,平均GS值為0.665。SRAP擴增結果的GS值在0.479～0.942，平均值為0.716，差別不大。根據所得條帶進行聚類分析，將21份馬蹄金材料按親緣關系遠近劃分為不同的類群，RAPD標記和SRAP標記都將21分材料劃分為2個類群，并可將SRAP聚類結果看作為RAPD聚類的細化。為了檢測供試材料間的RAPD和SRAP分析結果的相關程度，利用NTSYS-pc 2.10軟件的mantel對兩組數據進行了相關性分析，相關系數r0.01=0.910，二者存在極顯著正相關，說明優化后的RAPD和SRAP技術較為穩定，表明應用這2種技術對馬蹄金遺傳多樣性與親緣關系的分析具有較高的一致性和可信度。

圖3 基于Nei-Li 相似系數的21份馬蹄金材料RAPD-UPGMA聚類圖

圖4 基于Nei-Li 相似系數的21份馬蹄金材料SRAP-UPGMA聚類圖

3 討論

3.1馬蹄金種質資源的遺傳多樣性 王昆蕾等[21-22]對23份野生馬蹄金材料進行了形態學性狀和ISSR遺傳多樣性研究，結果表明，我國野生馬蹄金在形態上存在著豐富的遺傳變異，其中葉長、葉寬、草層高度、葉柄長、分枝數、主莖長以及葉片、匍匐莖顏色的變異都超過20%；形態學聚類分析將23份野生材料分為4個類群：大葉高叢型、大葉矮叢型、小葉矮叢型、小葉短莖型，ISSR中23份野生馬蹄金材料GS值為0.211～0.871，平均GS值0.394，該分子標記方法檢測的材料間遺傳距離較近。本研究通過RAPD和SRAP分子標記技術對西南地區野生馬蹄金植物的遺傳多樣性進行研究，從結果看，RAPD擴增結果的GS值在0.323～0.984,平均GS值為0.665，SRAP擴增結果的GS值在0.479～0.942，平均值為0.711，2種分子標記結果的遺傳多態性分別為68.78%與72.31%，說明本研究所用的種質具有一定代表性，且這些結果從分子標記的角度進一步說明了我國西南地區野生馬蹄金種質資源間存在豐富的遺傳變異。

3.2聚類結果與形態學相關性 聚類結果與形態學具有一定的相關性。在RAPD聚類中，云南材料YD200503、YD200504、四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407、貴州材料GD200502以及對照品種Common聚為第Ⅰ類，這9份材料的葉片偏大，草層高度整體較第Ⅱ類材料高，主莖長度總體比第Ⅱ類材料稍短；第Ⅱ類的12份種質除SD200308葉片相對較大以外，其他11份材料葉片較第Ⅰ類小，主莖節總體長于第Ⅰ類群，草層矮，分枝能力強。SRAP聚類與RAPD基本相同，材料的栽培品種，由于長期適應不同生長盡管貴州材料GD200502和美國對照品種的遺傳相似系數達0.905，親緣關系近，但兩者在形態特征和坪用特征上差異較大，解釋這一現象的最大可能性為GD200502是另一個有別于對照環境導致外觀形態出現變異，對二者是否屬于同一種可在今后的試驗中進一步深入研究。此外，近幾年來，為更好研究物種遺傳多樣性，研究者們傾向于采用多種分子標記探索物種基因信息。有研究[23]表明,不同的分子標記研究的結果可能是一致的，也可能并不一致,在許多情況下，形態同基因型間并無直接聯系，形態性狀的趨異不一定能反映遺傳上的趨異，形態性狀的相似也不一定意味著遺傳關系的近緣，兩個形態上有差異的個體可能在遺傳上非常的相似[25]。

3.3聚類結果與地理分布相關性 聚類結果除了與形態特征具有一定相關性外，與馬蹄金起源及分布范圍有關，這一結論與王昆蕾[22]ISSR分析結論相似，即：相似形態特征的材料能聚成一類，相近生境條件的材料也能聚成一類。如來自云南的材料YD200503、YD200504、YD200506、YD200505，雖然沒有聚在同一大類，但它們也在各大類中單獨聚在一起。四川材料SD200304、SD200303、SD200405、SD200801、SD200407，這5份材料遺傳距離較近，RAPD和SRAP聚類中，5份材料都能首先聚在一起，導致這種現象的原因可能與它們的起源和分布區域相似性有關。來自云南的2份材料YD200503和YD200504生態環境相似，也能相互聚在一起。另外，來自云南的2份材料YD200506、YD200505親緣關系很近，在SRAP遺傳相似系數分析中，二者GS值最高，達0.942，RAPD遺傳相似系數分析中GS值也高達0.934，二份材料的生態環境較接近，初步猜測很有可能是同一種，但兩者是否屬同一材料還有待于進一步研究。

3.4西南區野生馬蹄金種質資源的保護和開發利用 本研究結合前期形態遺傳多樣性研究，以1份美國品種為對照，對西南地區20份野生馬蹄金材料進行了RAPD和SRAP分子遺傳標記，通過兩種分子標記方法對比實驗，初步對不同野生馬蹄金植物形態特征及生物學特征存在的差異進行研究，了解馬蹄金種資源遺傳變異及其地理分布規律，對今后種質的保護研究以及野生資源的有效合理利用有重要意義。研究結果表明，我國野生馬蹄金材料間存在豐富的遺傳變異，應加強對其原生境保護或異地保護，防止人類活動造成的基因混雜。我國有大量野生馬蹄金分布，今后可擴大采集范圍，進一步開展野生材料的收集工作，為國內優良本土草坪草及地被植物馴化和育種提供豐富的種質資源。

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