HIV輔助受體CCR5常見小分子抑制劑抑制效果的綜合評價*

焦詩卉，何 淼

(中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)與大多數趨化因子受體一樣，屬于G蛋白偶聯受體，介導的信號傳導通路為Gq途徑；它主要由以下幾個部分組成：胞外N末端，3個胞外環，7個跨膜區域和胞內C末端[1]。CCR5是細胞膜上單核-巨噬細胞親和性的HIV-1輔助受體，也是β趨化因子MIP-1α、MIP-1β、RANTES等的天然受體。

艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的。在HIV 的感染過程(圖1)中，HIV與靶細胞融合，主要由包被糖蛋白gp120 和跨膜亞基gp41介導。gp120 與靶細胞上的CD4 分子和輔助受體(CCR5 或CXCR4)先后結合，導致gp41的構型發生改變，形成6 股α-螺旋束核心結構，將病毒包膜與靶細胞膜拉近，并發生融合，完成病毒進入宿主細胞的感染過程。因此，如果能夠有效抑制CCR5的作用，就能抑制HIV進入靶細胞，從而有效預防或治療HIV的感染。

圖1 HIV與細胞相互作用示意[2]

抑制劑的關鍵作用是抑制CCR5蛋白與gp120結合，從而有效阻礙HIV病毒進入靶細胞。1999年，自從日本Takeda公司成功開發出第一種CCR5小分子拮抗劑—TAK-779以來，針對CCR5的小分子抑制劑研究進展迅猛，相繼出現了多種TAK-779的衍生物；例如，Yao Liu(2008)等人合成了TAK-779酮衍生物，證明其能有效抑制HIV-1。2007年，由輝瑞公司研發的CCR5趨化因子受體拮抗劑馬拉韋羅(Maraviroc)成為了第一個被批準上市的CCR5拮抗劑藥物。隨后，SCH-C (SCH 351125)及其衍生物SCH 350634, SCH 350581，SCH 417690(Vicriviroc)也相繼開發并應用于臨床[3]。我國學者針對CCR5的小分子抑制劑進行的綜述中，將目前開發并進入臨床研究的小分子抑制劑分為7類：天然小分子類、苯并環庚烯類、哌啶類、螺環二酮哌啶類、托品烷類、4-哌啶-1-丁胺類和吡咯烷類[4]。

目前，有關CCR5常見抑制劑抑制效果的比較研究尚未見報道。本文通過構建CCR5常見抑制劑的三維結構，系統模擬各種抑制劑與CCR5蛋白分子的對接模式。通過比較各抑制劑對接模式的優劣，評估抑制劑的抑制效果；并嘗試尋找CCR5蛋白的優化對接靶點，篩選CCR5的候選最優抑制劑，為相關理論研究和藥物設計提供參考。

1 數據與方法

1.1 數據來源

CCR5蛋白三維結構信息下載自NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白數據庫。

CCR5小分子抑制劑的基本化學結構和基本分類方法參照劉瑤等(2007)的工作[4]。本文研究對象為CCR5小分子7類的29種常見抑制劑，主要包括：天然小分子類(抑制劑1-6)、苯并環庚烯類(抑制劑7-8)、哌啶類(抑制劑9-13)、螺環二酮哌啶類(抑制劑14-16)、托品烷類(抑制劑17)、4-哌啶-1-丁胺類(抑制劑18-23)和吡咯烷類(抑制劑24-29)。

1.2 數據處理與模擬分析

1.2.1 構建抑制劑的三維結構 采用Accelrys公司的Material Studio 5.5(MS)軟件的Materials Visualizer模塊，構建抑制劑的三維結構，按照藥效團分類輸出圖形。

1.2.2 模擬小分子抑制劑與CCR5蛋白分子對接效果 使用Discovery Studio 2.5(DS)軟件的LibDock模塊模擬小分子抑制劑與CCR5蛋白分子的對接效果，根據抑制劑與靶點對接時的對接模式和親和力進行綜合打分。參數設置如下：Numbers of Hotspots為0.25；Docking Preference為User Specified; Conformation Method為BEST；Parallel Processing為True。

1.3 小分子抑制劑抑制作用評估

在分子對接的模擬過程，可以得到分子對接絕對自由能(Absolute Free Energy，記為AFE)、對接姿態數(Conf Number，記為CN)、相對自由能(Relative Free Energy，記為RFE)，以及LibDock綜合得分(LibDock Score，記為LDS)等參數值。其中，絕對自由能和相對自由能代表了該抑制劑與位點對接所需的能量，通常絕對自由能和相對自由能越低，表明該對接位點的對接越緊密，即抑制劑對該位點的抑制作用越強。對接姿態數越大，表明抑制劑與該位點作用的可能性越大。LibDock綜合得分是LibDock模塊綜合絕對自由能、相對自由能和對接姿態數后，對該對接姿態的綜合性打分；LibDock綜合得分越高，抑制劑對該位點的抑制作用越強。最后，利用Excel將綜合得分均值排序，分析和評估抑制劑與CCR5靶點相互作用效果。

2 結果與分析

2.1 構建小分子抑制劑的三維結構

基于MS軟件，我們分別構建了7類抑制劑的三維結構。初步比較發現，各類抑制劑之間均具有部分相似的結構，該結構可能是抑制劑的藥效團，即與CCR5結合的部位。

2.2 小分子抑制劑對接位點與評估

研究證實，小分子抑制劑與CCR5蛋白選擇的結合位點主要在胞外部分[12-13]。同時，兼顧考慮到CCR5蛋白胞外N末端的結構特點，在CCR5蛋白潛在的13個可能結合位點中，我們縮小研究范圍，主要關注site2，site4，site6和site8等4個結合位點(圖3)。

2.2.1 CCR5的4個可能結合位點與小分子抑制劑的對接結果 綜合各抑制劑對site2,4,6,8的LibDock綜合得分, 以及各抑制劑與該4個位點結合的可能姿態數得到表1, 即各抑制劑與候選位點的LibDock綜合得分均值以及可能結合姿態數占總姿態數的百分比。

圖3 CCR5蛋白的4個可能結合位點

表1 CCR5可能的結合位點與小分子抑制劑結合綜合得分

在表1中，初步比較4個位點的LibDock綜合得分，可知Site 4的綜合得分最高，表明小分子抑制劑在該位置與CCR5蛋白結合最緊密。

分別統計4個位點所有可能的對接姿態數目占總的可能結合姿態數目的百分比(Docking Attitude Percent，記為DAP)，發現在site 4，對接姿態百分比達到了96.05%。因此，推斷CCR5的site 4是小分子抑制劑的主要作用位點，該位點也可能是抑制效果最優的位點。

2.2.2 小分子抑制劑的抑制作用分析與評估 系統計算各類小分子抑制劑與CCR5的site4結合的主要參數，包括AFE、RFE、GP和LDS的均值。具體計算結果見表2。

表2 各類小分子抑制劑與CCR5的site4結合的相關參數

依照LibDock綜合得分排序，抑制劑5、8、12、14、17、21和27在各自類別內綜合得分最高。因此，這7種抑制劑對CCR5蛋白的抑制作用可能相對較強。比較對接姿態百分比與LibDock綜合得分2個參數值，發現LibDock綜合得分的高低與對接姿態百分比的大小并無直接聯系。同時，考慮對接的相對自由能和絕對自由能，進一步發現，該3個數值共同影響了LibDock的綜合得分。

在天然小分子化合物類別中，通過比較LibDock綜合得分，初步得到該類別抑制劑的排序，即：抑制劑5>抑制劑1>抑制劑4>抑制劑6>抑制劑3>抑制劑2。Yoganathan等(2003)的實驗結論發現，甲氧基二氫暗褐菌素(抑制劑1)、暗褐菌素(抑制劑2)和Fuscinarin(抑制劑3)對CCR5蛋白抑制的 IC50值分別為154、21和80 μmol/L[5]，支持了我們的結論。該IC50值可以表示化合物對CCR5蛋白的抑制作用, 因此該值越大,表明對CCR5蛋白的抑制作用越強。

另一部分學者研究抑制劑對[125I]-RANTE與表達CCR5的中國倉鼠細胞(CHO) IC50值,該值表明了化合物對RANTE的抑制作用,因此數值越大,對RANTE的抑制作用越強,并對CCR5的抑制作用越弱。根據他們的研究，研究發現Sch351125(抑制劑9)對[125I]-RANTE與表達CCR5的中國倉鼠細胞(CHO)的IC50值為9.0 nmol/L[6]；Sch417690(抑制劑12)的抗病毒活性要比Sch351125(抑制劑9)高近10倍，其對R5型HIV-1的IC50值為0.1～3 nmol/L[7]。Wood A等[8]研發了進入臨床Ⅲ期的小分子抑制劑UK-427857(抑制17)，可以有效阻斷 [125I]-RANTE與CCR5的結合，其IC50值為7.18 nmol/L。以上實驗結果支持了計算得到抑制劑的抑制效果排序的結論，即：抑制劑12>抑制劑17>抑制劑9。

此外，默克公司研制的1,3,4-三取代吡咯烷化合物(抑制劑24)，其抗CCR5的IC50值為26 nmol/L。根據該類化合物改進獲得的抑制劑28和29，其IC50值分別為0.13和2.5 nmol/L[9]。同樣支持了關于吡咯烷類化合物抑制效果排序的計算推斷，即：抑制劑28>抑制劑29>抑制劑24。

2.2.3 候選抑制劑與site 4對接效果模擬 基于Discovery Studio軟件，可以獲得抑制劑與CCR5蛋白對接的結果，放大對接位點，去掉未與位點結合的分子，分析與位點結合的分子個數，以及所占的位點面積(圖4)。

初步比較發現，抑制劑8(圖4B)與site4的結合區域明顯大于其它抑制劑。按照結合區域的大小排序，依次為抑制劑14(圖4D)、抑制劑27(圖4G)、抑制劑21(圖4F)、抑制劑12(圖4C)、抑制劑5(圖4A)和抑制劑17(圖4E)。

但是，基于LibDock綜合得分得出的抑制劑效果排序為：抑制劑27>抑制劑8>抑制劑12>抑制劑14>抑制劑21>抑制劑5>抑制劑17。兩種方式獲得排序不完全一致，表明結合區域的大小與抑制劑的抑制效果不完全具有正相關關系?？赡苁墙Y合部位的分子類型或分子結構會影響到LibDock綜合得分。

圖4 抑制劑5、8、12、14、17、21和27分別與site4結合姿態放大圖

3 討 論

CCR5是目前治療HIV-1的新型靶點，有效抑制CCR5便能夠有效控制HIV-1病毒感染細胞。目前，國際上針對CCR5抑制劑的研究倍受關注。本文利用Accelrys公司的軟件Discovery Studio的LibDock模塊成功模擬了小分子抑制劑與CCR5蛋白的對接，計算推測了抑制劑的抑制效果排序，模擬了對接效果，為進一步藥物開發和臨床使用提供了參考。

計算分析得到了抑制劑的抑制效果排序，即：抑制劑27>抑制劑8>抑制劑12>抑制劑14>抑制劑21>抑制劑5>抑制劑17；并且，初步發現CCR5蛋白與小分子抑制劑結合的位置可能主要在第二個胞外環。因此，未來的小分子抑制劑的開發應著眼于CCR5的第二個胞外環，對哌啶類的抑制劑27進行修飾可能會發現具有更強抑制效果的抑制劑。

然而，相關實驗檢測吡啶類生物堿anibamine的三氟醋酸鹽(抑制劑6)，蛇胞菌素c(抑制劑4) 和19,20-環氧松胞菌素Q(抑制劑5)對CCR5的抑制效果，獲得的IC50值分別為1、40和60 μmol/L[10]。實驗結果與計算推測結論：抑制劑4>抑制劑5>抑制劑6，并不完全符合?？赡艿脑蚴?，軟件設計中未考慮到蛋白與小分子抑制劑在對接時可能發生構象的改變。

另外，TAK-220 (抑制劑23)具有很好的CCR5拮抗作用，IC50值3.5 μmol/L；它可以與CCR5上的第4、5、6跨膜區結合[11]，這與實驗的結論有所不同?？赡艿脑蛟谟?，本文分析了與大多數抑制劑結合的CCR5第二個胞外環，而TAK-220是一個較特殊的抑制劑，與大多數小分子抑制劑結構差異較大，這可能是導致抑制劑23抑制作用較低的一個重要原因。

雖然小分子抑制劑對CCR5具有很強的抑制作用，但是，它們易造成抗性的產生，導致拮抗劑的功能下降或喪失。通常小分子抑制劑只能作用于CCR5的單個位點，而多肽抑制劑則能夠與CCR5蛋白相互作用，從而結合多個位點。因此，多肽抑制劑具有更高的臨床意義，這也可能是未來CCR5拮抗劑開發的方向。

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