納米羥基磷灰石材料復合堿性成纖維細胞因子促進牙周組織再生的實驗研究

魯 紅，田 宇，吳織芬，王小勇

(1.第四軍醫大學口腔醫學院，陜西西安 710032;2.軍事科學院門診部，北京 100091)

應用組織工程技術有望實現真正意義上的牙周再生［1］，而選擇理想的生長因子載體和組織工程支架材料則是組織工程研究需要解決的首要問題［2］。納米羥晶/膠原仿生骨材料(nano-Hap/Collagen，nHAC)是一種新型納米羥基磷灰石材料，它仿照天然骨結構將膠原與羥基磷灰石復合，并用聚乳酸(Poly Lactic acid，PLA)修飾，從而在納米結構上與天然骨極為接近，具有良好的孔隙率和生物相容性［3］，如將其應用于牙周組織再生修復應能為牙周膜細胞(periodontal ligament cells，PDLCs)在缺損區的生長和分化提供支架和傳導作用，而若與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等生長因子聯合應用，則亦應能增加對PDLCs的誘導分化作用?；谝陨涎芯克悸?，本研究擬先通過體外研究觀察nHAC的支架結構和細胞相容性;再將bFGF與nHAC三維支架材料復合植入動物人工牙周缺損區，觀察分析其對牙周組織再生修復的影響和作用，以期為牙周組織工程生長因子載體和支架材料的選擇和應用提供實驗室依據，并為組織工程技術在牙周病治療方面的應用奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養液、胎牛血清(FBS)(Gibco，美國);胰蛋白酶(Sigma，美國);nHAC(清華大學材料系研制，清華大學崔福齋教授、廖素三博士惠贈);S-520掃描電鏡(日本);rh-bFGF(寶泰克生物技術有限公司);e-PTFE膜(上海塑料研究所);組織切片機(Leitz，德國);顯微鏡用測微尺(上海第三光學儀器廠);倒置顯微鏡和照相系統(Olympus，日本)。

1.2 HPDLCs在nHAC支架材料上附著、生長情況

1.2.1 nHAC 的預處理

取橫截面直徑為5 mm的nHAC圓柱體，根據實驗需要垂直于長軸切割成直徑為5 mm、厚1 mm的圓片，鈷60滅菌備用。

1.2.2 HPDLCs的體外培養

取因正畸需要拔除的新鮮第一前磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm碎塊，鋪于培養瓶底，加入含 100 mL/L FBS的α-MEM培養液，在飽和濕度、50 mL/L CO2、950 mL/L空氣、37℃標準環境下孵育。待細胞匯合達瓶底80%時，2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代，取4～8代細胞用于實驗。

1.2.3 HPDLCs接種至 nHAC 支架

取生長良好的第4代HPDLCs用2.5 g/L胰蛋白酶消化，1000 r/min離心7 min，收集細胞，用α-MEM培養液漂洗2遍后重懸，并調整細胞密度為5×106/mL。然后取0.2 mL細胞懸液分別接種于3個nHAC圓片上，并經負壓抽吸使細胞懸液充分進入nHAC的多孔間隙后，小心將負載細胞的nHAC圓片移至24孔板中，標準環境下孵育。2 h后再小心加入2 mL含100 mL/L FBS的α-MEM培養液，繼續培養，每24 h換液1次。

1.2.4 掃描電鏡觀察

培養72 h后，取PDLCs/nHAC三維立體培養標本用30 mL/L戊二醛固定，乙腈系列脫水，真空干燥，噴金鍍膜后掃描電鏡觀察HPDLCs在nHAC支架上附著、生長情況。

1.3 nHAC復合bFGF對牙周組織再生修復的影響

1.3.1 bFGF 與 nHAC 的復合

取一定量的bFGF直接溶于適量無菌蒸餾水中，然后加入一定數量的nHAC顆粒并進行真空抽吸，以使溶液盡可能吸入材料孔隙中，經凍干即得到復合的bFGF/nHAC，環氧乙烷消毒備用。

1.3.2 牙周組織缺損模型的制備和處理

取1～2歲、體質量15～20 kg的健康雄性雜種犬6只(第四軍醫大學西京醫院實驗動物中心提供)，常規麻醉后，以每只犬下頜兩側第2、3、4前磨牙共36個牙為實驗牙，翻開齦瓣，分別在每個牙的根分叉區制備頰舌向深度約為3.5 mm，垂直向高度約為4 mm的人工牙周組織缺損區，徹底刮除暴露于根面的牙周膜和牙骨質，并用細裂鉆在缺損區根面上作平齊于牙槽骨嵴的切跡，作為組織學觀察的標志點。然后將36個牙隨機分為空白對照組、單置 e-PTFE膜(單純引導組織再生)組和nHAC/bFGF加e-PTFE膜組。nHAC/bFGF/e-PTFE膜組植入nHAC-bFGF(經計算，每個牙位放置的 bFGF 量約為27 μg，nHAC 量約為 2.4 g)，縫合固定e-PTFE膜，最后縫合齦瓣，上塞治劑。單置e-PTFE膜組只覆蓋e-PTFE膜，空白對照組不作任何處理直接縫合。所有動物術后連續3 d肌注慶大霉素預防術后感染，且均進流食。

術后6周在麻醉下行二次手術，取出兩實驗組的e-PTFE膜，并觀察e-PTFE膜下根分叉區新生肉芽組織生長情況。

1.3.3 取材和組織學觀察

術后8周處死所有動物并取材，標本分切，脫鈣，組織切片，常規HE染色和改良Mallory三色法染色，光鏡下觀察新生牙周組織生長情況，并對其進行組織學測量。測量指標包括:①骨缺損高度(defect height，DH):根分叉頂至根方切跡底間距離;②新生牙槽骨高度(new bone formation，NB):根方切跡底至新生牙槽骨冠方頂間距離;③新生牙骨質高度(new cementum formation，NC):根方切跡底至新生牙骨質冠方頂間距離;④新生結締組織附著(new connective tissue，CT):根方切跡底至根分叉頂新生結締組織附著高度。

1.4 統計學分析

Excel 2003和SPSS 18.0軟件進行ANOVA方差分析，兩兩比較用SNK-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HPDLCs在nHAC上生長的形態學觀察

掃描電鏡低倍視野下可見HPDLCs在nHAC上生長茂密，細胞密度高(圖1);高倍視野下可見nHAC具有良好的多孔網狀結構，而HPDLCs在nHAC上生長旺盛，伸展充分，貼附牢固，細胞多呈長梭形，多圍繞孔隙或跨孔隙生長(圖2)。

2.2 術后6周膜下根分叉區新生肉芽情況

術后6周取膜時，可見根分叉牙周缺損處已被新生肉芽組織充滿，肉芽質地柔軟，與根面貼附緊密，無炎性滲出。

2.3 術后8周實驗部位肉眼觀察結果

各組動物實驗牙術區組織愈合良好，齦溝深度不超過1 mm，無明顯牙周炎癥，個別牙有1 mm左右的齦退縮。

2.4 組織學觀察和測量

光鏡下對動物組織切片進行組織學觀察可見:nHAC/bFGF/膜組較空白對照組和單置e-PTFE膜組有更多的新生牙槽骨、新生牙周膜和新生牙骨質樣組織生長，且未見上皮長入。新生牙槽骨幾乎充滿根分叉區;其新沉積的牙骨質從切跡底向冠方延伸，覆蓋根分叉的大部分區域;在牙周膜間隙內有平行及斜行的類Sharpey纖維插入新生牙槽骨和新生牙骨質(圖3)。而單置e-PTFE膜組新生組織量較nHAC/bFGF/膜組少，新生牙槽骨部分再生，未能充滿根分叉區，根分叉頂端膠原纖維大部分與牙面平行，新生牙骨質不完全(圖4)?？瞻讓φ战M新生牙周組織量更少，主要位于切跡內，并有大量上皮長入(圖5)。

各組新生牙周組織的量化比較(表1)可見:各組 DH 無顯著性差異(P ＞0.05)，而 NB、NC、CT 等指標均以 nHAC/bFGF/膜組最高，其次為單置e-PTFE膜組，空白對照組最低。各指標3組間相比差異均有統計學意義(P﹤0.05)。

圖2 HPDLCs伸展充分，圍繞孔隙或跨孔隙生長，可見nHAC的多孔網狀結構(SEM，×700)

圖3 術后8周nHAC/rh-bFGF/膜組根分叉牙周缺損處新生牙周組織幾乎充滿根分叉區，未見上皮長入(三色法，15 ×1.3)

圖4 術后8周單置e-PTFE膜組根分叉區新生牙周組織不完全，未見上皮長入(HE，15×1.3)

圖5 術后8周空白對照組根分叉區新生牙周組織量少，主要位于切跡內，并有大量上皮長入(HE，15 ×1.3)

表1 各組DH、NB、NC、CT等指標比較(mm，)

表1 各組DH、NB、NC、CT等指標比較(mm，)

不同字母組間P﹤0.05

DH NB NC CT空白對照組 12 4.26 ±0.21a 1.18 ±0.13a 1.26 ±0.10a 1.14 ±0.12組別 n a單置 e-PTFE 膜組 12 4.39 ±0.19a 2.82 ±0.18b 2.55 ±0.16b 2.65 ±0.13b nHAC/bFGF/膜組 12 4.22 ±0.17a 3.87 ±0.17c 3.82 ±0.20c 3.90 ±0.22c

3 討論

理想的組織工程載體應滿足以下要求［4］:①良好的生物相容性;②良好的生物降解性，且其降解速率必須與植入的細胞組織形成的速率相匹配;③良好的材料-細胞作用界面，利于細胞的粘附和增殖;④具有多孔性結構和一定的堅韌性，能支撐一定的三維立體結構，可提供種子細胞滲透和新生組織生長繁殖的足夠空間;⑤具有良好的可塑性，可以根據需要加工成各種形狀和大小。本研究應用的nHAC是一種納米尺寸的仿生骨材料，它在納米結構上與天然骨極為接近，因而具有更好的孔隙率和生物相容性［5］，其孔隙率高達80% ～90%，孔徑為100～600 μm，降解速率為6個月可降解80%以上，并已有研究證實此新型仿生骨材料促進和加快骨創愈合的作用明顯［3］。據此，本研究擬通過將體外培養的人PDLCs接種到nHAC三維支架上復合立體培養，使nHAC與牙周組織的主要功能細胞(PDLCs)直接接觸，觀察HPDLCs在nHAC三維支架上的生長情況，以初步評價nHAC的細胞相容性和應用于牙周組織工程的可行性。本研究中掃描電鏡觀察可見nHAC具有良好的多孔網狀結構，人HPDLCs在nHAC上貼附緊密，伸展充分，生長旺盛，提示nHAC具有良好的細胞相容性。

bFGF是一種能與肝素特異性結合的活性多肽，是中胚層和神經外胚層來源細胞的主要有絲分裂原和形態發生因子，具有廣泛的生物學作用［6］。體外實驗證實它能促進軟骨前體細胞的分化和軟骨細胞的增殖和成熟，增加異體骨基質誘導成骨量［7］。bFGF還是毛細血管增殖刺激劑，能夠促進毛細血管向骨斷端和骨移植物中生長，對成骨細胞的基因進行調節，促進骨形成［8］。有研究報道:bFGF與移植物的結合可增強移植物骨化，這與其促進血管形成，激活成骨細胞的活性有關［9］，Argün等［10］觀察到bFGF與脫礦骨基質結合后植入骨質缺損區，能夠增加骨質形成量，在牙周領域，Shirakata［11-12］等經動物實驗，證實將 bFGF 應用于牙周組織缺損修復，可促進牙周組織的再生重建。本研究擬在前期研究基礎上將bFGF與納米羥基磷灰石材料-nHAC相復合，bFGF賦予nHAC組織誘導活性，而nHAC則充當bFGF的載體支架，將此復合物應用于牙周缺損修復，為防止上皮向缺損部位長入，同時結合GTR技術，結果可見nHAC/bFGF復合體可明顯促進新生牙槽骨、新生牙骨質和新生牙周膜的生成，與空白對照組和單置e-PTFE膜組相比，具有顯著性差異，且實驗部位未見炎癥反應，從而證實bFGF與nHAC體內復合植入可更有效地促進牙周組織再生和重建，并進一步證實了nHAC良好的生物相容性和作為生長因子載體和牙周組織工程支架材料的應用潛能。

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