成體干細胞體外培養的安全性研究進展

張 文 李愛斌

一直以來，干細胞都是醫學領域的研究熱點，隨著對干細胞特性的逐步認識，干細胞技術得到了突飛猛進的發展，在再生醫學與組織工程等方面具有不可替代的應用前景。但是，隨著研究的深入，人們發現多數腫瘤的發生與干細胞有著一定的關系，腫瘤細胞與干細胞之間存在著一定的相似性。有多數學者提出了腫瘤源于干細胞的假說，近幾年也有腫瘤干細胞這一說法?，F在，已有研究表明干細胞在體外培養一定時間，即可發生突變。所以，干細胞的安全性已引起人們的高度重視。

一、干細胞

干細胞(stem cells，SC)是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的原始細胞，處于未定向分化狀態，同時具有增殖的能力。在一定條件下，可以分化成具有特異分子標志、特征性形態和特殊功能的成熟細胞。干細胞具有自我更新的能力是由于通過不對稱分裂的子代細胞維持了干細胞的潛能。根據干細胞發生學來源可以將其分為胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)和成體干細胞(somatic stem cell)兩種。胚胎干細胞屬于全能干細胞，發育等級較高，來源于胎盤和胎兒組織，是由受精卵發育而來的具有全能性的干細胞，分化潛能較廣［1］。成體干細胞，來源于成體器官或者成年個體組織，是存在已分化組織中的未分化細胞［1］。雖然成體干細胞的增殖能力有限，但是依然具有較強的自我更新和分化潛能，可以分化為某種或某幾種功能的體細胞，同時具有可塑性，可以打破胚層界限從而橫向分化為無關類型的成熟細胞或者在特定的環境下發生逆分化［2］。

二、腫瘤干細胞

隨著對腫瘤發生、發展研究的深入，有多數學者提出了腫瘤干細胞學說，認為腫瘤生長，復發和轉移是依靠腫瘤細胞中一定數量的具有干細胞特性的細胞群。1994年，人急性粒細胞白血病干細胞首次得到證實，之后又在乳腺癌瘤體中分離出腫瘤干細胞。2006年，腫瘤干細胞的定義于美國癌癥研究協會召開的腫瘤干細胞研討會上提出，即在腫瘤組織中具有自我更新能力，同時可以產生一系列異質性腫瘤細胞［3］。之后，腫瘤干細胞受到多領域的關切，陸續有研究證實，在不同的腫瘤組織中均存在腫瘤干細胞，比如腦部、皮膚、白血病、乳房、結腸、頭頸部、腎臟、肝臟、前列腺、和胰腺腫瘤，并且證實了腫瘤干細胞在耐藥，腫瘤復發和腫瘤轉移中起了主要作用［4～11］。

腫瘤干細胞具有很強的致瘤能力，也就是說腫瘤干細胞可以不斷自我更新，并形成不同分化程度的腫瘤細胞，但是腫瘤細胞會喪失不斷增殖的能力，最終死亡，所以說腫瘤干細胞在啟動腫瘤形成、生長中起決定性作用［12］。

三、腫瘤干細胞與正常干細胞的關系

目前，關于腫瘤干細胞的起源有不同的觀點，一種認為腫瘤干細胞源自正常干細胞，另一種認為腫瘤干細胞是正常體細胞突變而來?，F在，越來越多的研究結果支持第一種觀點:即腫瘤干細胞很可能是由正常干細胞在長期的自我更新過程中，發生了基因突變，使部分調控干細胞增殖分化的信號轉導通路中的信號蛋白發生了變化，被不正常的信號誘導為腫瘤干細胞。腫瘤的發生是一個多基因、多步驟的基因變化效應，是經歷了多階段后產生的，正常體細胞突變形成腫瘤需要復雜而漫長的過程，而成熟細胞半衰期短，所以，體細胞突變形成腫瘤的可能性小。而正常干細胞是唯一能夠自我更新的細胞，壽命長，更有可能積累足夠的突變基因，轉化為腫瘤干細胞。

腫瘤有可能源自干細胞增殖過程的任何階段受到阻斷，所以腫瘤分化程度與其相應起源的干細胞分化階段相關。如果阻斷發生在干細胞分化階段的早期，則腫瘤細胞就表現為低分化;如果阻斷發生在后期，腫瘤細胞表現為高分化。與之相應的是臨床上的良性腫瘤和惡性腫瘤之分。

隨著研究的深入，發現腫瘤干細胞與正常干細胞具有一些相似點，兩者都具有自我增殖和更新的能力，不過干細胞的增殖具有自穩定性，在增殖過程中，總數目保持恒定，而腫瘤干細胞僅僅表現出無限增殖的能力，并無自穩定性。干細胞具有遷移性，可遷移到特定的組織或者器官，與腫瘤干細胞的轉移能力相似。再者，腫瘤干細胞與干細胞的生長調控機制具有相似性，一些研究表明干細胞生長發育的信號轉導通路與腫瘤相關的經典信號通路相似，例如Bmi－1、Notch、Wnt、SHH等［13～15］。

干細胞在體內主要起到修復損傷組織的作用，組織受損即激活體內Hedgehog和Wnt信號途徑，使干細胞增殖分化，修復損傷的組織。如果機體處于長期受損狀態，Hedgehog和Wnt信號途徑就會一直被激活，這些信號傳導通路在細胞癌變方面也起到一定的作用，這時在環境或者致癌因子等不利因素的影響下，會導致信號傳導途徑中某些分子發生突變，引起干細胞過度增殖，形成腫瘤。有研究證實，如果間充質干細胞或者骨祖細胞向成骨細胞的分化途徑被阻斷，就會轉變為骨肉瘤［16］。

四、體外培養對干細胞的影響

干細胞在臨床的治療和應用前景已經明確，但是，由于人體內干細胞的數量有限，所以必需在體外大規模擴增干細胞。我們知道，任何生物體都有適應其生存的微環境，稱之為壁龕(niche)，干細胞的壁龕包括基膜成分、細胞外基質蛋白、間質細胞以及成體干細胞衍生的細胞因子等成分組成，壁龕的成分與結構特殊性是維持不同譜系干細胞處于相對未分化狀態的關鍵。所以，當干細胞在體外培養時，由于處于相對開放的環境中，并且接觸到一些血清、細胞因子、酶等一些化學和生物制劑，失去了原本適合其生存的壁龕，再加上干細胞與腫瘤干細胞的一些生物學特性極為相似，所以一些研究者就對長期體外培養的干細胞的生物學性狀以及安全性進行研究。

有研究者對豬骨的骨髓間充質干細胞進行體外培養，發現傳至40代以后，干細胞即出現老化的特征，比如說肌動蛋白過量積蓄，溶酶體酸牛乳糖苷酶活性增加，基質黏附性降低等。據文獻報道，在體外培養的晚期干細胞分化潛能以及分化能力下降，生物學特性已經發生改變。據2002年Science報道，將人類胚胎干細胞種植帕金森病的小鼠大腦內，一些小鼠體內的干細胞分化為多巴胺能神經元，但是另一些小鼠體內的干細胞分化為畸胎瘤導致小鼠死亡。在長期的體外培養過程中，由于染色體的不穩定和錯亂基因的堆積，正常的細胞周期失控，可能發生錯亂的信號調控，導致干細胞發生突變。有研究報道，將胚胎源性神經干細胞種植遺傳性退行性病變的患者中，在患者的脊髓和腦組織中發現了腫塊。Wu等通過向裸鼠皮下注射在體外傳至17代的神經源性干細胞，發現有個別裸鼠皮下有腫塊生長，取腫塊組織并進行原代培養，發現得到的細胞不僅保持干細胞的特性、表達干細胞標記蛋白以及CD133，同時還發現有異常染色體核型，并且具有快速增殖的特征，將這些細胞在體外長期培養并注入裸鼠皮下后發現，雖然這些細胞不具有皮下致瘤性，但是卻導致顱內腫瘤的發生。如何確保既能獲得充足數量的干細胞又能避免干細胞突變需要更進一步的研究。

五、干細胞安全性的主要檢測方法

干細胞移種植人體后，在體內的轉化過程更加不易控制，所以，需要對體外培養的干細胞進行嚴格的生物特性及安全性檢測，確保人體移植的安全性。目前，干細胞安全性的主要檢測指標大概包括以下幾種:①形態學觀察:應用倒置顯微鏡和透射電鏡對干細胞的形態和超微結構進行觀察;②細胞生長周期的檢測;③干細胞核型分析，采用G顯帶方法觀察染色體是否有缺失，易位和倒位、融合等異常變化;④裸鼠皮下致瘤性，觀察裸鼠皮下干細胞注射部位是否有腫塊形成;⑤檢測腫瘤相關基因的表達情況;⑥細胞凝聚實驗，使用植物凝集素ConA檢測細胞表面結構是否發生惡性轉化;⑦雙層軟瓊脂培養，使用雙層軟瓊脂培養基判斷細胞是否具有AIG特點(AIG∶即錨著獨立性生長，正常細胞在體外培養過程中必須附著于堅韌的表面，而惡性細胞失去貼壁依賴性，可在半固體基質中克隆)等檢測方法。

總之，干細胞的移植給醫學界帶來了希望，同時體外培養技術為干細胞的移植提供了可能性，但是由于干細胞在體外長期培養過程中會受到外界因素的影響，所以在臨床應用前還有很多的問題需要解決。找到成體干細胞體外培養最合理的擴增倍數，既能獲取大量純化的干細胞，又能保證在治療過程中的安全性和有效性，還需要進一步的努力。

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