肉毒桿菌及肉毒毒素研究進展

趙思俊，李雪蓮，曹旭敏，王 娟，王玉東，王君瑋，曲志娜

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物工程有限公司，山 東青島 266032）

2013年8月4日，國家質量監督檢驗檢疫總局通報了我國4家進口新西蘭恒天然公司受“肉毒桿菌”污染乳制品的企業名單，食品安全，尤其是嬰幼兒食品安全再一次引起人們高度關注。肉毒桿菌作為一種致命病菌，能引起肉毒中毒癥，引起全社會的高度關注?，F就肉毒桿菌及肉毒毒素的研究進展進行綜述，以期為加強食品安全監管提供技術支持。

1 肉毒桿菌

肉毒桿菌（Bacillus botulinus），又稱肉毒梭狀芽胞桿菌（Clostridium botulinum），是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，廣泛分布于自然界中，其芽胞在江河湖海的淤泥沉積物、塵土和動物的糞便中都有存在，水和土壤中的芽胞，是造成食物污染的主要來源。厭氧環境中，該菌分泌強烈的肉毒毒素，能引起特殊的神經中毒癥狀，對人類和動物的致死率很高，是毒性最強的蛋白質之一。因此，這種毒素還可用于制造生化武器。

肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT）最早是由E.van Ermengen在1897年調查比利時Ellezelles暴發的一次食源性傳染性時發現[1]，隨后，在世界各地都陸續報道過肉毒毒素中毒事件[2-4]。由于它具有厭氧生長、低溫生長產毒的特點，使其在日益普及的真空包裝、冷凍食品及罐裝食品中具有生長優勢，從而成為這類食品中毒的主要原因之一。

2 肉毒毒素——具有生物學意義的菌體產物

肉毒桿菌的致病性在于所產生的神經毒素——肉毒毒素，這些毒素能引起人和動物的肉毒中毒。根據肉毒毒素的抗原性，肉毒桿菌至今已有A、B、C（Cα和Cβ）、D、E、F、G等7個型，各型的肉毒桿菌分別產生相應型的毒素。其中，A、B、E、F型可引起人群中毒，C、D型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原，對人不致病。G型肉毒桿菌極少分離，未見G型菌引起人群中毒報道。我國肉毒桿菌食物中毒大多是由A型引起的，其他型相對較少。

肉毒桿菌屬于中溫菌，生長最適溫度25～37℃，產毒最適溫度20～35℃，最適pH為6～8.2，當pH低于4.5和超過9時，溫度低于15℃或超過55℃時，肉毒桿菌不能繁殖和形成毒素。另外，食鹽能抑制該菌的生長和毒素的產生，但是不能破壞已形成的毒素。提高食品中酸度也能抑制該菌的生長和毒素的產生。

肉毒毒素是目前已知的化學毒物與生物毒素中毒性最強烈的一種，其小鼠LD50為0.00625 ng，少至0.1～1.0 μg的肉毒毒素就可導致人中毒死亡。肉毒毒素是一種大分子蛋白質，A、B、E、F各型毒素均含有兩種蛋白質成分：神經毒素和無毒性的紅細胞凝集素。結構研究表明：肉毒毒素由輕鏈（L鏈，氨基端，50 KDa）與重鏈（H鏈，羧基端，100 KDa）通過一個二硫鍵連接[5]。其中重鏈與肉毒毒素的受體特異結合有關，其羧基端分子量約50 KDa的片段（Hc）是肉毒毒素的受體結合區（RBD），存在受體結合位點[6]，但是對受體結合區哪些片段在與受體的相互作用中發揮關鍵作用還缺乏足夠了解，研究還發現Hc片段是肉毒毒素的主要保護性抗原，含有中和性B細胞表位[7]。

肉毒毒素對消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）、酸和低溫很穩定，對堿和熱敏感，易于被破壞失去毒性。在正常胃液中24 h尚不能將毒素破壞。故吃了含有毒素的食品，毒素可以被胃腸道吸收。各種肉毒毒素的致病性雖相同，但一種毒素只能被其產生的抗毒素所中和，無交叉免疫，這在抗毒素血清治療上有重要意義。

3 肉毒毒素的致病機制

肉毒毒素的作用包括結合、定位和麻痹3個階段[8]。一旦毒素與神經細胞受體或具有內吞作用的間接受體結合后，抗體就不能中和毒素。接著內涵體的酸性發生變化，啟動毒素轉運區域構象發生變化，同時囊泡腔在囊泡膜質子泵ATP酶作用下酸化，暴露出一個疏水區域，在膜上產生一個離子通道，L鏈通過此通道進入胞液。在胞內，毒素分解三種蛋白釋放Ach，導致肌 肉松弛或痙攣麻痹[9]。

輕鏈和重鏈的N端結構由1個保守的二硫鍵連接，在二硫鍵存在的狀態下，毒素重鏈HN結構域形成一條環形結構，將深陷于輕鏈表面裂縫中的鋅離子催化部位遮蔽，從而不表現酶活性[10]。在雙鏈毒素進入神經細胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現出酶活性，催化部位能夠容納底物16個氨基酸殘基。與催化部位的鋅離子形成配位鍵的除了2個組氨酸殘基的咪唑環、1個結合于保守谷氨酸的水分子外，還有1個谷氨酸羧基，1個色氨酸分子也可能參與了配位。毒素輕鏈的這種獨特的配位形式、空間結構與已知的金屬蛋白酶并不相同，屬于一個新型的金屬蛋白酶家族[11]。

4 肉毒毒素中毒的主要類型

肉毒毒素中毒根據其傳播途徑不同可分為3個類型，分別是食源性肉毒毒素中毒、嬰兒肉毒毒素中毒、創傷性肉毒毒素中毒[12-14]。在目前己知的病例中，食源性肉毒毒素中毒占絕對多數，其次是嬰兒肉毒毒素中毒。

4.1 食源性肉毒毒素中毒

食源性肉毒毒素中毒主要是由于進食了含有肉毒毒素的食品所引起，也是人類肉毒毒素中毒最普遍的一種形式。

食品在制作過程中被肉毒桿菌芽孢所污染，制成后未徹底滅菌，芽孢可在厭氧環境中發芽繁殖、產生毒素，食前又未加熱烹調，已產生的毒素被食后引起食物中毒，多見于罐頭食品、乳制品、真空包裝食品和冷凍食品等，在我國，肉毒中毒大多由發酵的豆制品和面制品所致。

4.2 嬰兒肉毒毒素中毒

嬰兒肉毒毒素中毒由于新生兒正常菌群缺乏，其食入的肉毒桿菌芽孢可以萌發、繁殖、產生毒素，從而引起嬰兒中毒。

嬰兒的發病年齡通常在2周到8個月，年齡在9個月以上的嬰兒未見相關報道。嬰兒中毒A型多于B型，F型極為罕見。1歲以下的嬰幼兒不宜食用蜂蜜，因為蜜蜂在采集花粉釀蜜的過程中，很容易把被肉毒桿菌污染的花粉和蜜帶回蜂箱，導致蜂蜜中含有的肉毒桿菌較多，容易引起嬰兒肉毒毒素中毒。芽孢在人體內一般不能出芽，但由于嬰兒腸道的特殊環境，可能引起感染和中毒。臨床表現為先是便秘，繼而出現頭頸部肌肉軟松、吮乳無力、吞咽困難、眼簾下垂、全身肌肉松弛減退，可持續8周以上。只要注意營養和護理，一般可在1-3月內自然恢復，嚴重者亦可因呼吸麻痹而導致嬰兒猝死。嬰兒肉毒病是肉毒桿菌感染后在體內繁殖產生毒素所致，屬于感染性中毒，與單純性中毒不同。

4.3 創傷性肉毒癥

創傷性肉毒中毒，類似破傷風，由于傷口處污染的肉毒桿菌芽孢繁殖、產毒，毒素從傷口進入血液循環，隨血流到達神經系統后引起肉毒中毒而導致。

5 肉毒毒素中毒的臨床癥狀

肉毒中毒的臨床表現與其他食物中毒不同，胃腸道癥狀少見，主要為運動神經末梢麻痹。臨床表現包括因肌肉活動不協調而出現肢體歪斜，舌外伸，食物的取用、咀嚼、吞咽出現困難。意識正常，如果未出現繼發感染，體溫仍保持正常。

該病潛伏期18～72 h，先有一般不典型的乏力、頭痛等癥狀，隨后眼肌麻痹，開始出現復視、斜視、眼瞼下垂等，后來發展至咽喉部肌肉麻痹，吞咽、咀嚼困難，進而隔膜麻痹、呼吸困難，重者可死于呼吸困難與衰竭，病死率在30%以上。

6 肉毒桿菌和肉毒毒素的檢測方法

由于肉毒桿菌的致病性主要在于其產生的外毒素，并且由于肉毒桿菌屬于厭氧菌，培養條件要求高，一般實驗室不具備這樣的條件，所以檢測的重點主要是對肉毒毒素的檢測。目前實驗室中常用的檢測肉毒毒素的方法是基于抗原抗體反應、針對毒素蛋白的檢測，還有小鼠致死及中和實驗、膠體金免疫層析法等，另外，也有少量采用分子生物學方法檢測肉毒毒素基因的報道[15-18]。

6.1 肉毒桿菌的厭氧分離培養與鑒定

將可疑食物或嘔吐物煮沸1 h可以殺滅非芽胞桿菌，接種于血瓊脂平板厭氧培養；或將可疑材料在65～80℃條件下加熱30 min，然后37℃培養24 h，涂片檢查細菌形態，并作生化鑒定。對于E型菌的芽孢還需要用溶菌酶處理，用血瓊脂平板在厭氧條件下培養。根據生化反應和毒素的產生進行鑒定，可采用免疫熒光方法鑒定某些代謝群的菌株，還可編碼各種毒素的基因設計引物進行PCR擴增。

6.2 小鼠毒素中和試驗

對于傳統的檢測方法，小白鼠腹腔注射法是目前對肉毒毒素活性與定性的標準分析方法。該方法靈敏度高，但檢測周期長，至少需要4天；另外還存在使用實驗動物帶來高成本的缺點，同時需要較復雜的實驗操作。因而，近年來主要研究利用被動血凝反應測定、放射免疫測定、凝膠擴散測定、酶聯免疫測定、肽鏈內切酶酶聯免疫測定等，大多采用免疫法，檢測單個樣品的時間可以縮短到幾個小時。由于免疫法主要基于分子識別，在肉毒毒素失活或部分失活的情況下，也可能檢出。也就是說，免疫方法只能測定是否存在肉毒毒素分子，而不能測定其活性，在測定活性或毒力時，仍需要采用小白鼠腹腔注射法。

6.3 其他檢測方法

康彥等[19]采用毛細管電泳激光誘導熒光檢測聯用技術分離檢測肉毒毒素A與其人工合成多肽底物反應后的產物來對其活性進行分析，該方法具有需要樣品量少，分析速度快等優點。蘇裕心等利用SmartCycler系統，建立了一種高敏、特異、簡便、快速的檢測肉毒桿菌等多種食源性致病菌的熒光定量PCR方法[20]。

近年來，基因芯片法以其具有集成化、微型化、自動化、高通量等特點，被廣泛用于病原菌的檢測。金大智等[21]以16S rDNA和23S rDNA基因作為檢測靶片段，選取15種常見腸道致病菌作為基因芯片檢測的靶細菌，設計和篩選通用性引物和特異性探針，優化兩重PCR反應體系，并探討核酸提取方法、引物不對稱比例、鎂離子濃度、退火溫度、退火時間、雜交溫度、雜交液成分等因素對基因芯片雜交的影響。成功建立了包括肉毒桿菌在內的15種腸道致病微生物的基因芯片檢測法，并用于臨床診斷。

7 肉毒毒素的預防和治療

肉毒毒素的防治，主要采用疫苗預防和使用保護性抗體進行被動免疫治療。疫苗是預防肉毒中毒的最有效的方法。臨床診斷往往不能有效區分中毒的肉毒毒素類型，治療時多使用多價的馬血清抗毒素[22-23]。

7.1 肉毒毒素疫苗

目前肉毒毒素疫苗的類型主要有：肉毒毒素的類毒素疫苗、肉毒毒素亞單位疫苗、肉毒毒素的DNA疫苗等。目前國外使用較多的肉毒毒素的類毒素疫苗是福爾馬林滅活的五價疫苗。但該疫苗只含有七個血清型中的5種（A-E），不能抵抗F和G型肉毒毒素的攻擊[24]。研究表明，肉毒毒素的Hc片段包含保護性抗原基本決定簇，作為免疫原能引發顯著保護性免疫應答，A和B型毒素Hc重組蛋白的高效表達也有一定的進展[25-26]。

7.2 肉毒毒素的治療

7.2.1 肉毒毒素拮抗劑：小分子化合物和肽類物質對肉毒毒素的毒性可以起到一定的抑制作用，毒素拮抗劑成為肉毒毒素中毒防治的新途徑[27-28]。

肉毒毒素拮抗劑的靶目標主要是：1）膽堿能運動神經末端的表面結合位點。肉毒毒素的H鏈首先與膽堿能神經末梢的突觸前膜上的受體結合；2）毒素的中和抗原表位；3）毒素輕鏈的活性部位。阻斷毒素與膽堿能運動神經末端受體的結合相對困難，與之相比，抑制毒素與中和抗原表位的結合顯得更加有效，能夠延緩機體死亡，而不能有效防治癱瘓。研究發現，一些鋅離子試劑、金屬蛋白酶抑制劑等可以抑制肉毒毒素輕鏈的活性。

7.2.2 肉毒毒素抗毒素：常用的方法是以福爾馬林類毒素免疫小鼠以制備單克隆抗體，然而研究表明無論作為免疫原或抗原，肉毒毒素類毒素和毒素之間存在顯著的差異。目前，研究者正致力于新型抗毒素的研究。Cenci[29]以體外表達肉毒毒素輕鏈片段為免疫原制備鼠單克隆抗體，雖然在體內不能抑制毒素的毒性，但是可以防止毒素引起的神經遞質釋放的抑制。Pless等[30]用毒素Hc片段制備了單克隆抗體，從而確定了A型肉毒毒素的Hc中至少有2個不同的中和抗原表位。其他研究也表明用單抗封閉毒素Hc上的表位，也可在一定程度上有效預防和治療肉毒毒素中毒。

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