Otoferlin蛋白與聽毛細胞突觸傳導＊

郭旭堯 綜述 袁偉 張學淵 審校

在哺乳動物中，耳蝸基底膜突觸囊泡是聽覺感知的重要部分，它通過纖毛細胞機械傳導，調節Ca2＋通道的Ca2＋內流從而刺激遞質釋放傳入感覺中樞。為了維持適當的Ca2＋濃度，體內系統會產生多種多樣的功能蛋白：比如感覺神經系統中的Ca2＋“傳感器”—海馬鈣蛋白（hippocalcin）、視錐蛋白（visinin）和恢復蛋白（recoverin）。近年來，在耳蝸聽毛細胞中，發現了一種新的蛋白質—Otoferlin，其分子量約230kDa，可能在聽毛細胞中充當著Ca2＋“傳感器”的角色，并且對維持正常聽力起重要作用。本文就Otoferlin蛋白在耳蝸聽毛細胞突觸囊泡中的功能進行綜述。

1 Otoferlin蛋白的結構

Otoferlin蛋白是由OTOF 基因最長亞型編碼的一種特殊蛋白質，存在6個Ca2＋結合區域—C（2）區域，其中4個含有完整的5個天冬氨酸殘基，可以和Ca2＋結合；這個最長亞型包含48個外顯子，其中外顯子1未被編碼，編碼長度為1 997個氨基酸的類ferlin蛋白Otoferlin［1～3］；并且它的Ca2＋結合區域還可以與胞漿磷脂酶A2、突觸結合蛋白I（synaptotagmin I）、Ras相關的GTP 結合蛋白等結合，在細胞膜運輸、信號傳導及神經遞質釋放等方面起著重要作用［4］。OTOF 基因家族有兩個亞型：一種含有DysF，一種缺失DysF。無脊椎動物通常只有兩個OTOF基因（1個含有DysF和1個缺失DysF），大多數的脊椎動物含有6個OTOF 基因（3個含有DysF和3個缺失DysF）。幾乎所有的Otoferlin蛋白都含有1個N－terminalC2－FerI－C2“三明治”樣結構、1個FerB基因序列和2個毗鄰的C－末端C（2）跨膜結構區域［C（2）E 和C（2）F］，它們是保持Otoferlin蛋白功能的基本結構；而DysF、C（2）E和FerA 是可以選擇的，屬于OTOF 基因的結構拓展域，它們缺失也能保持Otoferlin蛋白的基本功能［5］。通過以甘氨酸、天冬氨酸代替Otoferlin蛋白Ca2＋結合區域的C（2）F結構域試驗，證明Otoferlin蛋白的C（2）F是Ca2＋結合至關重要的結構域，對帶狀突觸囊泡的融合起至關重要的作用［6］。重組蛋白質研究發現Otoferlin蛋白6個C（2）區域中的5個能感受Ca2＋，在膜表面親和力高達7倍，其解離常數達到13～25uM；重組膜融合試驗發現這5個C（2）區域能刺激激活Ca2＋依賴性的膜融合，同時還發現C（2）C 區域不能結合Ca2＋，不能刺激膜融合［7］。在1.95－A 分辨率下發現Otoferlin蛋白的C（2）鈣離子結合區域N 末端晶體結構C2－A，這個C（2）區域擁有完整的8個β－折疊，并且與突觸結合蛋白、蛋白激酶C 亞型和磷脂酶類序列有點類似，而且它的頂部環狀結構相比Otoferlin的其他C（2）區域顯著縮短。C2－A 這個帶正電荷的C（2）區域與其它典型的C（2）區域頂部圍繞的帶有負電荷的“頸”狀隆起不一樣，C2－A 這個C（2）區域不能結合Ca2＋，而且也不能結合磷脂膜，因此，其它沒有帶正電荷的β－折疊C（2）區域才能結合磷脂酰肌醇－4，5－二磷酸［8］。

2 Otoferlin蛋白的表達

利用免疫組織化學法和原位雜交的方法發現Otoferlin蛋白在Wistar大鼠的耳蝸、前庭、耳蝸螺旋神經節、前庭神經核、小腦、海馬回和睪丸均有表達［9］。在未成熟的小鼠耳蝸中Otoferlin蛋白主要表達在內毛細胞，在外毛細胞和螺旋神經節細胞著色較淺，在球囊、橢圓囊、半規管的神經纖維及前庭神經元I型細胞上也有表達；但是Otoferlin蛋白在成年小鼠耳蝸中僅在內毛細胞高度表達，而支持細胞上沒有表達，并且集中表達于內毛細胞基底膜外側，而內毛細胞也正是在此處與傳入神經元的樹突形成獨特的帶狀突觸進行信號傳導，同時利用免疫組化染色和膠體金技術在小鼠耳蝸切片標記中發現，55%的Otoferlin顆粒位于帶狀突觸附近，其中21%位于突觸前膜上，4%位于突觸部位附近胞質中［10］。在Otoferlin蛋白中鑒定出一種單克隆抗體HCS－1（hair cell soma－1），其在帶狀突觸免疫染色不集中，推測Otoferlin蛋白除了在聽毛細胞傳入突觸囊泡胞吐釋放發揮作用外可能還有其他的功能，同時還發現Otoferlin蛋白主要分布在內毛細胞基底膜外側和帶狀突觸囊泡胞漿中，它緊密附著在基底膜上，是一種不溶性鈣鹽濃縮物［11］。

3 Otoferlin蛋白在聽毛細胞突觸傳導中的功能

Otoferlin蛋白在耳蝸的表達與內毛細胞傳入神經突觸之間有顯著的關聯，這意味著Otoferlin蛋白可能是內毛細胞突觸前膜結構的重要組成部分，因此推測Otoferlin蛋白是一種含有Ca2＋結合區域的跨膜功能蛋白，充當著Ca2＋“傳感器”的角色，在內毛細胞帶狀突觸前膜融合，從而對內毛細胞傳入突觸囊泡的分泌發揮著重要作用［12］。實驗發現OTOF基因敲除純合子小鼠表現為極重度聾，聽性腦干反應（ABR）不能引出，其內毛細胞與傳入神經元所形成的帶狀突觸形態正常，Ca2＋的流通也正常，但是突觸囊泡的分泌作用卻完全停止［10］。關于它是如何在帶狀突觸前膜融合的，Roberts［13］提出如下假說：Otoferlin蛋白開始主要集中在突觸帶周圍的突觸囊泡胞漿中，Ca2＋內流與其結合，定向釋放到突觸前膜的結合位點，激活預先固定在結合位點的SNARE蛋白復合體（syntaxin－1A 和SNAP－25），然后促使突觸囊泡與質膜緊密融合并釋放神經遞質。

聽毛細胞突觸結合蛋白復合體中有兩種主要SNARE靶蛋白：syntaxin－1A 和SNAP－25，他們與Otoferlin蛋白相互作用；同時發現Otoferlin的Ca2＋結合區域C（2）F與C（2）D 是Ca2＋結合最重要結構域，SNARE 蛋白復合體主要結合在C（2）F（P1825A）結構域［14］。實驗發現通過突變Ca2＋結合區域改變Otoferlin結合syntaxin－1A 和SNAP－25能力，改變Cav1.3通道Ca2＋流通效率，可以間接調節Otoferlin對突觸囊泡分泌釋放而影響內毛細胞的功能。為了解耳蝸內毛細胞囊泡分泌過程中Otoferlin與突觸結合蛋白之間的關系，Beurg等［15］通過測量出生4 天的鼠內毛細胞電容，發現其是Ca2＋依賴性分泌，Otoferlin可能是構成Ca2＋依賴性膜融合的基礎功能蛋白，是增加內毛細胞帶狀突觸囊泡融合概率和同步性的必要蛋白；早期分泌物中檢測到Sty1、Sty2、Sty7幾種突觸結合蛋白，Sty1和Sty2這兩種中樞神經系統突觸中常見的Ca2＋“傳感器”在成熟內毛細胞中沒有表達［15］。通過比較內毛細胞、腎上腺嗜鉻細胞和海馬神經元三種細胞分泌模型系統中Otoferlin和Sty1的功能發現，將Sty1基因異位表達于OTOF 敲除小鼠培養的胚胎內耳器官中，沒有激活它的Ca2＋依賴性分泌，Otoferlin蛋白過度表達于敲除Sty1的嗜鉻細胞和海馬神經元，也沒有恢復局部分泌，但是增強了海馬神經元的遞質釋放［16］。之后Pangrsic等［17］提出假說：Otoferlin蛋白與快相釋放囊泡（RRP）補充融合關系密切。他們在DFNB9耳聾鼠的模型中發現，用天冬氨酸和甘氨酸突變代替Otoferlin 蛋白C（2）F 區域，評估其RRP、Ca2＋信號和囊泡的功能，加入突觸后電流的大小變量和波峰值測試，發現突變型小鼠比野生型小鼠快相釋放囊泡RRP 恢復補充減少且速度緩慢。

然而并不只有syntaxin－1A、2A 和SNAP－25是與Otoferlin相互作用的蛋白質，有研究顯示除了突觸結合蛋白－1和突觸結合蛋白－2這兩種經典的突觸融合蛋白外，通過酵母菌雙雜交技術發現了一種新的與Otoferlin 有關的蛋白myosinVI，通過免疫共沉淀法發現內毛細胞基底膜外側Otoferlin和myosinVI兩種相互作用蛋白，通過比較兩種蛋白質的突變體發現，兩種蛋白質對突觸成熟起到了互補作用：①內毛細胞Otoferlin突變的小鼠其Cav1.3通道Ca2＋生物電活動嚴重減退，CtBP2／RIBEYE標記的突觸囊泡分泌作用嚴重下降；②內毛細胞myosinVI突變的小鼠其耳蝸頂回毛細胞區域的膜BK＋通道生物電活動衰退，Ca2＋依賴性分泌效率下降；③內毛細胞兩種蛋白突變的小鼠顯示出標記的突觸蛋白數量減少和形態改變［18，19］。

Engel等［20］對外毛細胞Ca2＋相關通道功能研究發現，耳蝸低頻區外毛細胞Ca2＋通道在敲除Otoferlin 蛋白后的反應比高頻區外毛細胞敏感。Beurg等［21］通過研究動物未成熟外毛細胞的Ca2＋通道和Otoferlin蛋白相關的分泌作用發現，新生小鼠敲除OTOF 基因后，其不成熟的外毛細胞Ca2＋通道生物電活動正常，但是突觸囊泡的分泌作用卻完全停止。Johnso等［22］利用Ca2＋試劑盒和全細胞膜片鉗技術，精確檢測未成熟沙鼠毛細胞膜電容變化，間接地反映突觸囊泡分泌作用，提出Otoferlin蛋白不論是在內毛細胞的高Ca2＋依賴性的突觸囊泡分泌作用，還是在與外毛細胞Ca2＋的線性關系上，都是作為耳蝸毛細胞Ca2＋“傳感器”而影響著聽神經帶狀突觸囊泡的膜融合和分泌釋放。因此，Otoferlin蛋白不僅在毛細胞Ca2＋通道活動中起到至關重要的作用，可能同樣作用于未成熟的外毛細胞Ca2＋通道。

Brandt等［23］的研究表明甲狀腺激素可以調控未成熟毛細胞Ca2＋和K＋通道活動，他們質疑Otoferlin蛋白是毛細胞突觸囊泡分泌作用的必需蛋白質。Schuowatzki等［24］提出OTOF 基因敲除的動物，突觸活動仍然存在，只是膜電容測量顯示突觸囊泡融合減少。而且，還發現Otoferlin不僅通過結合SNARE蛋白復合體和Ca2＋的方式參與帶狀突觸囊泡的融合及神經遞質釋放，也可以通過和Rab8b鳥苷酸三磷酸酶共同作用參與跨高爾基體的運輸過程［25］。在小鼠的一些非神經組織內也見到了Otoferlin蛋白的陽性表達，說明Otoferlin蛋白可能并不是唯一與Ca2＋通道活動相關的蛋白質，可能也參與了其它一些細胞的運輸過程［1］。

4 Otoferlin蛋白的研究前景

雖然目前關于Otoferlin蛋白的結構、表達和功能研究取得了一定的進展，然而目前關于聽毛細胞中Otoferlin蛋白作為Ca2＋“傳感器”控制Ca2＋依賴性的突觸囊泡分泌釋放還存在幾個疑問：①免疫組織化學和mRNA 檢測指出Otoferlin廣泛分布于中樞神經元和神經纖維中［9］，其在這些位置的作用機理不清；②部分沒有Otoferlin表達的哺乳動物模型也有胞吐作用［23］，為什么？③耳蝸不同部位、不同年齡導致Ca2＋依賴性胞吐敏感性改變，但Otoferlin蛋白的分泌沒有明顯變化［4］；④Otoferlin蛋白影響耳蝸聽毛細胞傳入突觸囊泡胞吐釋放，但是在前庭毛細胞是否有作用沒有進一步研究［10，24］；缺乏Otoferlin蛋白的形態學和定量研究。因此，Otoferlin蛋白表達的影響還需要不斷的深入研究；同時，Otoferlin蛋白除了作為Ca2＋“傳感器”外，是否還存在其它的生理功能，都需要進一步的研究。

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