谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量測定方法的比較

李亞平， 玉崧成， 于 斐， 吳擁軍， 張洪權

(1．鄭州大學公共衛生學院 河南鄭州450001;2．鄭州大學化學與分子工程學院 河南鄭州450001)

0 引言

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是全球性污染谷物的霉菌毒素之一，大量存在于小麥、玉米等谷物以及谷物類制品中［1］．DON能引起食欲下降、器官損傷、代謝紊亂以及生長抑制等癥狀［2－3］，對免疫功能以及神經元結構功能產生明顯的影響［4］．另外還具有致畸、胚胎毒性，可能是一種潛在的致癌物質［5－7］．DON的危害已引起不少國家的重視，我國的國家標準GB 2761—2011(食品中真菌毒素限量)中規定谷物及其制品中的DON最高限量為1 mg/kg．目前測定谷物中DON常用的方法主要包括薄層色譜［8］、酶聯免疫［9］、氣相色譜［10］、液相色譜［11］以及色譜與質譜聯用技術等［12－14］．我國食品中 DON 的測定為免疫親和層析凈化高效液相色譜法(GB/T 23503—2009)，谷物及其制品中DON的測定為薄層色譜測定方法及免疫測定方法(GB/T 5009．111—2003)．作者建立了測定DON含量的ELISA和HPLC法，并對這兩種方法進行了方法學比較．

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

DON單克隆抗體(Envirlogix);DON標準品(Sigma公司);HRP標記羊抗鼠IgG二抗(上海佑隆生物科技有限公司);顯色劑A、顯色劑B(河南華美生物公司);嘔吐毒素免疫層析親和柱(北京華安麥科生物技術有限公司);其他試劑均為分析純．

高效液相色譜儀系統(美國戴安公司);酶標儀(WELLSCAN MK3，Thermo);UV-1606紫外分光光度儀(日本島津);FW-100型高速萬能粉碎機(北京中興偉業儀器有限公司);快速混勻器(XK96-A，姜堰市新康醫療機械有限公司)．

1．2 間接競爭ELISA法

(1)一抗、二抗稀釋液和封閉液的考察 以引入無關蛋白盡可能少的原則，對1%OVA的PBS、1．25%OVA的CB、0．02%BSA的PBS和10%NBS的PBS這四種常用一抗、二抗稀釋液和封閉液優化，根據吸光度的大小選擇1%OVA的PBS作為一抗、二抗稀釋液和封閉液．

(2)抗體和包被抗原工作濃度的考察 分別將抗體和包被抗原進行倍比稀釋，通過競爭棋盤滴定實驗，選擇抗體最佳濃度12 μg/mL、包被抗原1∶8稀釋為最佳條件．

(3)最佳實驗條件的考察 通過正交試驗對最佳包被條件、一抗及二抗孵育時間進行考察，選擇對抗原結合反應抑制率高、吸光度大、適合快速檢測的組合．最終選取包被條件是4℃過夜(12 h)，一抗最佳孵育時間是60 min，二抗最佳孵育時間是60 min．

(4)樣品前處理 將待測玉米(小麥)樣品用高速萬能粉碎機粉碎，過300目的分子篩，用四分法稱取5 g通過分子篩的待測樣品于250 mL錐形瓶中，加入25 mL 10%的乙腈－水提取液．置于快速混勻器上震蕩10 min，過濾，收集濾液．取適量濾液或其稀釋液進行ELISA檢測分析．

(5)標準曲線的繪制 配制一系列質量濃度為10、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL 的 DON，以 DON質量濃度的對數log C為橫坐標(x)，以DON標準樣品各濃度孔的吸光度為縱坐標(y)，繪制標準曲線．

1．3HPLC 法

(1)色譜條件 參照GB/T 23503—2009食品中DON的測定(免疫親和層析凈化高效液相色譜法)，選擇色譜實驗條件如下:色譜柱為Agilent XDB－C18柱(5 μm，4．6 mm×250 mm);流動相為甲醇－水(體積比20∶80);流速為0．8 mL/min;柱溫為35℃;進樣量為20 μL;檢測波長為218 nm;檢測器為紫外檢測器．

(2)樣品前處理 將待測玉米(小麥)樣品用高速萬能粉碎機粉碎，過300目的分子篩，用四分法稱取25 g通過分子篩的待測樣品于100 mL容量瓶中，加入5 g聚乙二醇8 000，用水定容至刻度線．置于快速混勻器上震蕩10 min，過濾至濾液澄清，收集濾液．

(3)樣品濾液的凈化與洗脫 準確移取濾液2．0 mL，參照DON免疫親和柱說明書進行凈化、洗脫．收集全部洗脫液用于HPLC檢測分析．

(4)標準曲線的繪制 用流動相稀釋 DON 標準品母液至質量濃度分別為0．1、0．2、0．5、1．0、2．0和5．0 μg/mL的標準工作液，以DON標準工作液質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線．

2 結果與分析

2．1 間接競爭ELISA法的方法學考察

(1)線性回歸方程 在10～1 000 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y=－0．332 9x+2．750 7，相關系數 r= －0．981 3．

(2)靈敏度 測定陰性孔10次，計算陰性孔平均值(A陰)及標準方差(SD)，根據公式A=A陰－2SD，計算出分析檢測限為 0．043 μg/mL．

(3)實際樣品的準確度及精密度 分別向經前處理且其含量已知的小麥和玉米樣品中添加一定質量濃度的DON標準品，配成高、中、低三個質量濃度，每個質量濃度測定6次，結果如表1所示．玉米的平均回收率為96．8%，RSD的平均值為8．8%;小麥的平均回收率為97．3%，RSD的平均值為4．4%．

表1 ELISA法的回收率結果(n=6)Tab．1 Results of recoveries by ELISA

2．2 HPLC法的方法學考察

(1)線性回歸方程 在0．1～5 μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為y=0．570 1x+0．036 4，相關系數 r=0．998 7．

(2)靈敏度 將DON標準品母液逐級稀釋，直到信號值與噪音值之比為3∶1時，確定此時信號值對應的質量濃度即為HPLC法的檢測限．實驗測定的DON檢測限為0．1 μg/mL．

(3)實際樣品的準確度及精密度 分別向經前處理且其含量已知的小麥和玉米樣品中添加一定質量濃度的DON標準品，配成高、中、低三個質量濃度，每個質量濃度測定6次，結果如表2所示．玉米的平均回收率為92．7%，RSD的平均值為6．8%;小麥的平均回收率為92．7%，RSD的平均值為3．1%．

表2 HPLC法的回收率結果(n=6)Tab．2 Results of recoveries by HPLC

2．3 兩種檢測方法測定結果的比較

(1)靈敏度比較 ELISA 法的檢測限為0．043 μg/mL，HPLC 法的檢測限為0．1 μg/mL．由此可知，ELISA法檢測限低，靈敏度高．

(2)準確度比較 由表1和表2可知，ELISA法對實際樣品的回收率較好，準確度高．相對而言HPLC法回收率低，準確度低，這可能與HPLC法前處理的復雜程序有關．

(3)精密度比較 將兩種方法高、中、低三個質量濃度RSD的平均值進行方法學的比較，可知兩種方法的精密度沒有顯著性差異．

3 結論

由ELISA和HPLC方法學數據比較得出，ELISA法簡便快速，其靈敏度高于HPLC法，能夠對谷物類糧食中的微量DON進行監測．ELISA法回收率高，這可能是由于HPLC前處理極其復雜，處理過程會造成待測毒素一定程度的損失，從而造成HPLC法回收率偏低．ELISA和HPLC法的精密度沒有顯著性差異，在實驗中都可以通過更加規范化的操作來提高精密度．

綜上可知，ELISA法不需要繁雜的前處理，可以批量快速檢測，且具有高靈敏度和準確度．HPLC樣品前處理過程復雜，需要專業人員操作，所需設備昂貴．所以ELISA法在現場快速檢測谷物中DON含量方面更具有優勢．

［1］ Ruiz M J，Franzova P，Juan-García A，et al．Toxicological interactions between the mycotoxins beauvericin，deoxynivalenol and T-2 toxin in CHO-K1 cells in vitro［J］．Toxicon，2011，58(4):315 －326．

［2］ Sato I，Ito M，Ishizaka M，et al．Thirteen novel deoxynivalenol-degrading bacteria are classified within two genera with distinct degradation mechanisms［J］．FEMS Microbiol Lett，2012，327(2):110 － 117．

［3］ Pestka J J．Deoxynivalenol:mechanisms of action，human exposure，and toxicological relevance ［J］．Arch Toxicol，2010，84(9):663－679．

［4］ Girardet C，Bonnet M S，Jdir R，et al．Central inflammation and sickness-like behavior induced by the food contaminant deoxynivalenol:a PGE2-independent mechanism［J］．Toxicol Sci，2011，124(1):179 －191．

［5］ Pestka J J．Toxicological mechanisms and potential health effects of deoxynivalenol and nivalenol［J］．World Mycotoxin Journal，2010，3(4):323 －347．

［6］ Moon Y，Kim H K，Suh H，et al．Toxic alterations in chick embryonic liver and spleen by acute exposure to fusarium-producing mycotoxin deoxynivalenol［J］．Biol Pharm Bull，2007，30(9):1808 － 1812．

［7］ Ma Yiyi，Guo Hongwei．Mini-review of studies on the carcinogenicity of deoxynivalenol［J］．Environmental Toxicology and Pharmacology，2008，25(1):1 －9．

［8］ 金秀娟，朱旭東．脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測［J］．糧食加工，2010，35(3):87－89．

［9］ Lattanzio V M T，Nivarlet N，Lippolis V，et al．Multiplex dipstick immunoassay for semi-quantitative determination of Fusarium mycotoxins in cereals［J］．Analytica Chimica Acta，2012，718(9):99 －108．

［10］ Hallier A，Celette F，David C．Effects of sampling and extraction on deoxynivalenol quantification［J］．Food Chemistry，2011，127(1):303－307．

［11］ Setyabudi F M C S，Nuryono N，Wedhastri S，et al．Limited survey of deoxynivalenol occurrence in maize kernels and maizeproducts collected from Indonesian retail market［J］．Food Control，2012，24(1/2):123 － 127．

［12］ Zou Zhongyi，He Zhifei，Li Hongjun，et al．Development and application of a method for the analysis of two trichothecenes:deoxynivalenol and T-2 toxin in meat in China by HPLC-MS/MS［J］．Meat Science，2012，90(3):613 －617．

［13］ Tran S T，Smith T K，Girgis G N，et al．A survey of free and conjugated deoxynivalenol in the 2008 corn crop in Ontario，Canada［J］．Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92(1):37 －41．

［14］高軍俠，萬昊雷，劉作新．Florisil柱凈化玉米、水稻及糙米中黃曲霉毒素的最優化條件研究［J］．鄭州大學學報:理學版，2005，37(2):101 －103．