亞精胺對誘導DNA凝聚行為的影響研究

汪小平，王向紅,2,?

（1.溫州大學物理與電子信息工程學院學院，浙江溫州 325035；

2.溫州職業技術學院，浙江溫州 325035）

亞精胺對誘導DNA凝聚行為的影響研究

汪小平1，王向紅1,2,?

（1.溫州大學物理與電子信息工程學院學院，浙江溫州 325035；

2.溫州職業技術學院，浙江溫州 325035）

利用原子力顯微鏡技術（AFM）研究了亞精胺加入次數及不同培養時間對DNA凝聚行為的影響.研究表明，DNA的凝聚行為取決于亞精胺的加入次數和培養時間.隨著加入次數的增加，DNA凝聚減慢、凝聚體尺寸變大；隨著培養時間的增加，DNA凝聚體變得越來越緊湊.本研究可為DNA凝聚行為的藥理特性和生物學效應提供科學依據.

AFM；亞精胺；DNA凝聚；加入次數；培養時間

在特定的時期，活細胞控制著DNA的凝聚和解聚任務，例如在細胞生命周期內遺傳密碼使得基因得以表達[1-2]，同時長鏈DNA儲存在微米大小的區域內[3].在基因的復制和傳遞過程中，這種凝聚機制是一種很重要的保護機制，從外部保護了遺傳信息的安全性.研究DNA凝聚的詳細過程可以幫助我們了解DNA如何被組織染色，以及如何發展成基因運載工具[4].近年來，科學家對DNA凝聚做了大量研究.在體外實驗中，Gosule等[6]通過電子顯微鏡首次觀察到在缺少ATP和蛋白質的存在下，正三價的亞精胺可直接誘導DNA凝聚成為環狀、棒狀的結構.Wilson等[7]通過光散射手段研究了同價態的陽離子，如Na+、Mg2+、正三價的亞精胺和正四價的精胺對DNA凝聚的影響.事實上，多價陽離子[8-10]、酒精[11]、蛋白質[12]、中性的凝聚聚合物[13]和一些抗癌藥物[14]都可以誘導DNA凝聚成不同的形態.但是值得注意的是，多價陽離子誘導DNA凝聚過程與生物體內的DNA有序存儲過程有著許多共同特征，該凝聚主要取決于多價陽離子的價數，而不是多價陽離子的結構[15].研究還發現，使DNA凝聚的凝聚體的大小除了取決于采用的凝聚劑外，還受陽離子的濃度和添加時間的影響.同時，在不同培養時間[16]，不同濃度下形成的不同形態的十二烷基溴凝聚體，最后可以釋放成原始形式[17].

本文利用原子力顯微鏡技術（AFM）研究了不同亞精胺加入次數和樣品不同培養時間對DNA凝聚行為的影響，分析DNA在亞精胺作用下凝聚行為的變化，為亞精胺誘導DNA凝聚行為的藥理特性和生物學效應提供依據.

1 材料和方法

1.1 試劑

λ-DNA（DNA濃度為500 ng/μL，儲存條件為：100 m mol/L，Tris-HCl，pH 8.0，10 m mol/L NaCl，1 m mol/L EDTA），亞精胺（100 μ mol，C7H19N3?3HCl，Mr 254.6），購自華美生物工程公司（分析純），純水（18.2 m?cm）是經過密理博超純化系統去離子與凈化處理.

1.2 DNA凝聚體樣品的制備

先分別加120 μL水、1.2 μL DNA到A、B、C、D無菌管中.A管不加亞精胺；B管一次性加入亞精胺60 μL；C管先加亞精胺30 μL，20 min后再加入亞精胺30 μL；D管先加入亞精胺10 μL，然后每隔20 min加10 μL亞精胺，直到加完60 μL亞精胺為止.靜置10min.見圖1.

圖1 不同陽離子加入次數示意圖

1.3 AFM觀察

分別從A、B、C、D管底部取8 μL溶液，滴加到新鮮解離的云母片表面.約3 min后，用氮氣吹干，然后用AFM進行觀察.AFM參數：微懸臂長為200 μm，力常數為0.12 N/m，掃描速度一般為3.0 – 5.0 Hz，成像模式為接觸式，圖像采集為height方式.

2 結果與討論

2.1 不同陽離子加入次數下DNA凝聚行為

用AFM對凝聚體進行觀測時，制樣過程快速、簡單，僅涉及到DNA吸附到云母基底的快速干燥過程.因此，我們所觀測的結果基本上能代表凝聚體在溶液中的固有狀態.

圖2所示是未添加亞精胺的DNA的AFM圖像，從圖中可以看出，由溶液的自由狀態直接吸附到云母基底的DNA分子呈線性舒展狀態.圖3所示是在不同的亞精胺陽離子加入次數（垂直）和不同的培養時間（水平）下，用原子力顯微鏡觀察亞精胺誘導的DNA凝聚體圖像.由圖2和圖3的形貌對比我們可以知道，加入亞精胺前后DNA的狀態有明顯不同，加入亞精胺后DNA由圖2的線性舒展形式變為網狀或者球狀凝聚體形式，這表明亞精胺可以誘導DNA凝聚.

圖2 未添加亞精胺的DNA的AFM圖

圖3表示不同的亞精胺陽離子加入次數與不同的培養時間情況下，亞精胺誘導DNA凝聚的AFM圖象（掃描范圍為5 μm×5 μm）.從圖3可以看出，線性舒展的DNA在亞精胺加入1 min后迅速開始凝聚，說明亞精胺的加入起到了決定作用.當亞精胺（陽離子）的加入次數不同時，凝聚劑與DNA形成的凝聚體在結構和尺寸上表現不同.當亞精胺加入次數為1時，自由伸展的DNA在亞精胺加入的最初1 min內迅速開始凝聚，而且分布比較均勻.當培養時間為15 min時，DNA局部凝聚成網狀凝聚結構.當培養時間更長，為60 min時，所有的DNA鏈全部坍塌成球狀結構.當亞精胺加入次數為2時，DNA鏈在1 min時也快速凝聚，但是DNA凝聚體更緊湊；隨著培養時間的增加，DNA鏈折疊成小片，然后那些微小的小片結合成串狀；經過長時間的模擬，為60 min時，所有的DNA分子鏈凝聚成緊湊的球狀結構.當亞精胺加入次數為6時，DNA在亞精胺加入的1 min內凝聚成很緊湊的網狀結構，當培養時間為15 min時，緊湊的網狀結構開始減小，最后當培養時間達到60 min時，DNA全部凝聚成了尺寸很小但是很緊湊的球狀結構.

圖3 不同的亞精胺加入次數與不同的培養時間情況下, 亞精胺誘導DNA凝聚的AFM圖象

亞精胺的加入次數不同，凝聚過程是不一樣的.其中陽離子的加入次數最少（1次）的情況下，DNA自由伸展的時間比較短，DNA凝聚的比較快，亞精胺一加入，DNA鏈很快凝聚，沒有時間弛豫，凝聚體尺寸比較小，最后凝聚成尺寸比較小的網狀結構；陽離子的加入次數最多（6次）的情況下，DNA凝聚的比較慢，一邊弛豫一邊凝聚，凝聚體尺寸比較大，最后導致DNA凝聚成尺寸比較大的球狀結構.

2.2 不同培養時間下的DNA凝聚行為

從圖3可以看出，當培養時間為1 min時，一次添加亞精胺的DNA快速凝聚成了分布均勻的網狀結構；二次添加亞精胺的DNA凝聚體呈網狀結構，分布較為均勻；六次添加亞精胺的DNA也凝聚成了網狀結構，但凝聚體尺寸卻比前面（見圖3中a1圖和b1圖）的大且更緊湊.當培養時間為15 min時，一次添加亞精胺的DNA局部凝聚成了網狀結構，二次添加亞精胺的DNA也出現了分布不均勻的凝聚結構，六次添加亞精胺的DNA凝聚體呈現個別比較緊湊的網狀機構.當培養時間為60 min時，一次添加亞精胺的DNA全部坍塌成了尺寸很小的球狀結構，二次添加亞精胺的DNA坍塌成了球狀凝聚體且凝聚體尺寸開始增大，六次添加亞精胺的DNA全部坍塌成了尺寸稍大的球狀凝聚體結構.

研究發現，隨著培養時間的增加，DNA分子的形態從比較大的緊湊的網狀結構變成了較小的高度緊湊的球狀結構，凝聚尺寸變小，凝聚體凝聚得越來越緊湊.

3 結 論

本文采用原子力顯微鏡技術研究了亞精胺誘導DNA凝聚行為的變化特征，得到如下結論：

（1）亞精胺可以誘導DNA凝聚.

（2）當亞精胺一次加入時，DNA凝聚快，凝聚體尺寸比較小且呈現網狀結構；隨著加入次數的增加，DNA凝聚減慢，凝聚體尺寸變大且呈現球狀結構.

（3）隨著樣品培養時間不同，DNA凝聚體緊湊程度呈現明顯差異.

[1] Jenuwein T, Allis C D.Translating the histone code [J].Science, 2001, （293）：1074-1080.

[2] Bednar J, Horowitz R A, Grigoryev S A, et al.Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin [J].Proc Natl Acad Sci, 1998, （95）：173-178.[3] Bloomfield V A.DNA condensation [J].Curr Opin Struct Biol, 1996, （6）：334-341.

[4] Duguid J G, Li C, Shi M, et al.Therapy for human cancers using cisplatin and other drugs or genes encapsulated into liposomes [J].Biophys, 1998, （74）：2802-2814.

[5] Besteman K, van Eijk K, Lemay S G.Interplay of ion binding and attraction in DNA condensed by multivalent cations [J].Nat.Phys, 2007, （3）：641-644.

[6] Gosule L C, Schellman J A.Compact form of DNA inducedby spermidine [J].Nature, 1976, （259）：333-335.

[7] Wilson R W, Bloomfield V A.Counterion-induced condensation of deoxyribonucleic acid.A light-scattering study [J].Biochemistry, 1979, 18（11）：2192-2196.

[8] Ou Z，Muthukumar M.Langevin dynamics of semiflexible polyelectrolytes：Rod-toroid-globule-coil structures and counterion distribution [J].The Journal of chemical physics, 2005, 123（7）：4905-4909.

[9] Schnurr B, MacKintosh F, Williams D.Dynamical intermediates in the collapse of semiflexible polymers in poor solvents [J].EPL, 2000, （51）：279-285.

[10] Hud N V, Vilfan I D.Toroidal DNA condensates：Unraveling the Fine Structure and the Role of Nucleation in Determining Size [J].Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure, 2005, （34）：295-318.

[11] Arscott P, Ma C, Wenner J, et al.DNA condensation by cobalt hexaammine （III）in alcohol-water mixtures：dielectric constant and other solvent effects [J].Peptide Science, 1995, 36（3）：345-364.

[12] Kundu T, Rao M.DNA condensation by the rat spermatidal protein TP2 shows GC-rich sequence preference and is zinc dependent [J].Biochemistry, 1995, 34（15）：5143-5150.

[13] Lerman L.A transition to a compact form of DNA in polymer solutions [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1971, 68（8）：1886-1890.

[14] Hou X M, Zhang X H, Wei K J, et al.Cisplatin induces loop structures and condensation of single DNA molecules [J].Nucleic Acids Research, 2009, 37（5）：1400-1410.

[15] Widom J, Baldwin R L.Loop dependence of the stability and dynamics of nucleic acid hairpins [J].Biopolymers, 1983, 9（22）：1595-1620.

[16] Ran S Y, Wang Y W, Yang G C, et al.Proteomic identification of proteins involved in the anticancer activities of oridonin in HepG2 cells [J].Phys.Chem.B, 2011, （115）：4568-4575.

[17] Li C, Tian H, Duan S, et al.Proteomic identification of proteins involved in the anticancer activities of oridonin in HepG2 cells [J].Phys.Chem.B, 2011, （18）：163-169.

The Effects of Spermidine on DNA Condensation Behavior

WANG Xiaoping1, WANG Xianghong1,2
（1.School of Physics and Electronic Information, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035；
2.Wenzhou Vocational ＆Technical College, Wenzhou, China 325035）

By using atomic force microscopy （AFM）, we systematically studied the effects of spermidine-adding times and culture time on DNA condensation.The research showed that：DNA condensation strongly depends on the spermidine-adding times and culture time.With the adding times increasing, DNA condensates slowly, and DNA condensation becomes bigger；with culture time increasing, DNA condensates fast, and DNA condensation becomes more and more compact.The conclusions of this study can provide the scientific basis for the pharmacological characteristics and biological effects of DNA condensation behavior.

AFM；Spermidine；DNA Condensation；Adding Times；Culture Time

Q-336

A

1674-3563（2013）02-0024-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2013.02.005 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

（編輯：封毅）

2013-01-09

國家自然科學基金（20774066，20974081，21174131，21104060）；國家自然科學基金重點項目（20934-04）

汪小平（1988- ），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向：高分子物理.? 通訊作者，wangxh@wzu.edu.cn