西藏地區藏北嵩草附著乳酸菌的理化特性

高 靜，郭旭生，王國成

(1．蘭州大學草地農業科技學院,甘肅 蘭州730020； 2.蘭州大學生命科學學院，甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學青藏高原生態系統管理國際中心，甘肅 蘭州 730000)

高寒草地畜牧業是西藏農牧民賴以生存的基礎，是西藏經濟發展的主要支柱，更是國家生態安全的基本保證[1]。西藏地區被稱為“世界第三極”，氣候極端，生態環境脆弱，畜牧業發展面臨牧草生長緩慢、畜群結構不合理及天然草地退化等問題，限制了西藏草地畜牧業的快速發展。青貯飼料不僅適口性好、消化率高，還能長期保存，且受氣候和外界環境影響較小，可以有效改善西藏飼料短缺的困境[2-3]。因此，青貯飼料是解決西藏地區草畜季節性供應不平衡的理想措施之一。

目前，我國主要是通過購買國外商品乳酸菌進行青貯飼料的調制，這些商品菌適宜的生長溫度一般是25 ℃，但西藏地區牧草收獲期氣溫較低，一般只有15 ℃。同時，有關乳酸菌篩選的研究主要為常規條件下的乳酸菌研究，而就極端環境中乳酸菌有關理化特性和應用基礎等方面的研究鮮有報道。我國大多乳酸菌在青貯飼料中的研究主要為利用商品化乳酸菌制劑進行試驗[4-7]，而有關牧草中天然附著乳酸菌的篩選研究與應用方面還十分薄弱，最近幾年才有所報道[8-11]。關于我國高寒地區乳酸菌的研究有高原酸奶、青貯飼料和類開菲爾粒中提取的相關報道[12]，但有關高寒地區牧草附著乳酸菌的研究還未見報道。在我國高寒高海拔地區，通過牧草青貯發酵可以獲得優質的青貯飼料，這些青貯飼料色綠、酸香味濃、適口性好，幾乎沒有二次發酵的現象[13-14]，說明在我國高寒地區或許存在可以在低溫環境中發酵飼料的特殊乳酸菌。針對以上情況，開展我國高寒地區牧草附著乳酸菌特性的研究十分必要，而對其與其它生境提取的乳酸菌理化性質的比較研究也很重要。因此，本研究以西藏高寒地區分布范圍廣、面積大、牧草飼用價值較高的藏北嵩草(Kobresialittledalei)為原料[15-16]，對其附著乳酸菌進行鑒定，并對比研究其與對照菌株的生理生化等特性，明確青藏高原乳酸菌特性，為其在飼料青貯、酸奶發酵等應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1菌株 試驗所用乳酸菌菌株是從2010年7月初采自西藏高寒草甸的藏北嵩草中分離純化，并采用傳統培養法和16S rRNA序列分析鑒定后得到的，詳見楊楊等[17]的方法。將于-80 ℃保存的菌株活化后，接種到MRS斜面培養基上培養，在4 ℃條件下保存備用。

1.2培養基 試驗用培養基參考凌代文[18]的方法配制。

MRS培養基：葡萄糖20.00 g，牛肉膏10.00 g，蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g， K2HPO45.00 g，檸檬酸銨2.00 g，MnSO40.25 g，CaCO32.00 g，乙酸鈉5.00 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，瓊脂粉20.00 g，1 mL吐溫-80，加蒸餾水1 000 mL，調pH值至6.20，121 ℃下滅菌15 min。

PY基礎培養基：100 mL蒸餾水中加入1.00 g酵母提取物，0.50 g胰酶解酪朊，0.50 g蛋白胨，4.00 mL鹽溶液。其中鹽溶液為1 000 mL蒸餾水中溶入10.00 g碳酸氫鈉，1.00 g磷酸二氫鉀，0.48 g MgSO4·7H2O，0.20 g氯化鈣，1.00 g磷酸氫二鉀，2.00 g氯化鈉。

1.3試驗儀器和設備 超凈工作臺(YJ-875，蘇州凈化設備公司)，高壓滅菌鍋 (MLS-3780，三洋公司)，pH儀(E-201-C，上海雷磁儀器廠)，恒溫培養箱。

1.4試驗設計 試驗采用隨機區組設計，研究3種分離的乳酸菌腸膜明串珠菌腸膜亞種、融合魏斯氏菌和食物魏斯氏菌在不同溫度、不同pH條件下的生長特性及糖發酵、耐鹽等特性，并以相對應的3種標準菌作為對照。

1.5試驗測定項目

1.5.1不同溫度條件下各菌株的生長特性 將備好的MRS培養液以5 mL量分裝試管，于121 ℃高壓滅菌15 min。將試驗菌株以相同的接種量(0.1 mL)接入培養液中，搖勻，塞子封口，各設兩個重復，分別放在溫度為4、10、15、25、30、40和50 ℃的水浴鍋中培養，其中4、10 ℃培養14 d，40、50 ℃培養7 d，其余培養2 d，觀察菌株的生長情況。

1.5.2不同pH條件下各菌株的生長特性 所用培養基是將MRS培養液用鹽酸或氫氧化鈉調pH值至所需酸堿度，即pH值分別為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0和9.5。同上步驟，將試驗菌的液體培養基以100 μL的接種量分別接入滅過菌的培養基中，各設兩個重復，置于30 ℃恒溫培養箱培養7 d后，觀察菌株的耐酸堿能力。

1.5.3各菌類的耐鹽特性 所用培養基是在MRS培養液中加入所需NaCl，將備好的MRS培養液(3% NaCl、6.5% NaCl和18% NaCl)以5 mL量分裝入試管。經121 ℃高壓滅菌15 min，將試驗菌株以相同的接種量(0.1 mL)接入所需培養基中，各設兩個重復，置于30 ℃恒溫培養箱中培養7 d并觀察菌株的耐鹽能力。其中NaCl的百分含量是指100 mL培養液中含有NaCl的克數。

1.5.4糖源利用試驗 按Cai等[19]相關文獻介紹，本次糖源利用試驗共挑取了乳糖、阿拉伯糖、蔗糖、葡萄糖、D-核糖、苦杏仁苷、甘露糖、麥芽糖、鼠李糖、棉子糖、水楊苷、果糖、半乳糖、密二糖、纖維二糖、葡萄糖酸鹽、七葉苷、山梨醇和甘露醇，共19種糖源。試驗采取了糖發酵生化反應管法(發酵試劑由杭州天和微生物試劑有限公司提供)。試驗同時設置無糖處理(培養基中末加所需測定的糖。但接種試驗菌株)和空白處理(培養基中加入所需測定的糖，但末接種試驗菌株)，各設兩個重復。操作方法參照生化反應管的說明書進行(將已經培養好的不同試驗菌用接種針分別接入含有不同糖的反應管中，放置30 ℃的培養箱中培養2 d，觀察發酵情況)。

1.5.5精氨酸產氨試驗 采用的培養基是在PY基礎培養液中加入精氨酸液。將試驗菌株分別接種于含精氨酸和不含精氨酸的培養基，以作對照。30 ℃的培養箱中培養3 d，再將培養好的培養液倒入比色皿中，添加奈氏試劑，如果有氨產生則會有橙黃色或黃褐色沉淀出現。反應現象明顯強于對照組認為是陽性反應。

配置精氨酸液：在10 mL蒸餾水中加入1.50 g·L-1精氨酸和0.05 mL半胱氨酸， pH值調至7.0，滅菌，吸取3滴到3 mL PY基礎培養液中。

奈氏試劑：A液為50 mL的蒸餾水中加入20.00 g KOH；B液為5.00 g KI和10.00 g HgI2溶入至50 mL蒸餾水所得溶液。A液和B液混合均勻，過濾，存于棕色瓶備用。

2 結果

2.1藏北嵩草分離乳酸菌的鑒定結果 本試驗分離得到19個菌株，經過傳統培養法和16S rRNA序列分析，分離鑒定出3種菌，分別是腸膜明串珠菌腸膜亞種2株，融合魏斯氏菌11株，食物魏斯氏菌6株(表1)。

2.23種試驗菌的生理特征比較 從藏北嵩草分離的3種試驗菌(融合魏斯氏菌、食物魏斯氏菌和腸膜明串珠菌腸膜亞種)都能在4 ℃下生長，而且在10 ℃時生長活力旺盛，但相同的3種對照菌在10 ℃才能微弱生長甚至不生長(表1)。試驗菌株在6.5%的NaCl培養基中生長良好，部分菌株還能在18%的NaCl培養基中生長，而對照菌株未生長。在不同pH值下，大多菌株可以在pH值為4.0～9.0的范圍內生長，部分試驗菌株能在pH為3.0或9.5的條件下生長，而對照菌株在pH為3.0或9.5時未生長。

2.33種試驗菌的生化特征比較 3種試驗菌都可以利用葡萄糖產生酸；魏斯氏屬中除了1個菌株外，其它菌株都能利用阿拉伯糖；在半乳糖的利用情況上，魏斯氏屬有15個菌株可利用半乳糖，而有2個菌株為不確定反應(表2)。對照菌組融合魏斯氏菌不能利用棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但能發酵半乳糖、纖維二糖、麥芽糖、D-核糖等；食物魏斯氏菌株能利用阿拉伯糖，但不能利用半乳糖等；但本試驗中提取魏斯氏屬菌株的糖源利用試驗表明，提取菌株均能利用阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、纖維二糖、麥芽糖、果糖和蔗糖等。同樣，試驗菌株腸膜明串珠屬除了不能利用葡萄糖酸鹽和鼠李糖外，均可利用葡萄糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露糖、纖維二糖、棉籽糖、果糖、蔗糖、半乳糖、七葉苷、密二糖、水楊苷和苦杏仁苷。根據腸膜明串珠屬乳酸菌的糖源利用鑒定方法，常規條件下的腸膜明串珠腸膜亞種對麥芽糖、半乳糖、D-核糖、甘露糖、水楊苷、密二糖的發酵能力較差，一般也不能利用精氨酸產氨，但是本試驗所提取的試驗菌可以利用上述幾種糖類，并且可以利用精氨酸產氨。

表1 3種試驗菌及其對照菌的生理特征Table 1 Physiological characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

表2 3種試驗菌及其對照的生化特征Table 2 Biochemical characteristics of three kinds of test bacteria’s and their controls

3 討論

李文斌等[22]和張剛[23]報道，當溫度為30～40 ℃時常規明串珠和魏斯氏菌生長旺盛，且其最適pH為5.5～6.2，當pH≤5時可以生長，pH<4.4 則停止生長，而在初始堿性或中性環境中生長速率降低。在4 ℃的條件下，從藏嵩草中分離的乳酸菌能夠生長，而溫度達到10 ℃時生長旺盛，但本試驗的菌株對溫度的要求遠遠低于從日本東京的青貯飼料中分離出的3種菌株(食物魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和腸膜明串珠菌腸膜亞種)，它們在10 ℃條件下只能微弱生長[19-20]。青藏高原高寒環境的特殊性可能是造成本研究中乳酸菌對低溫適應特性的主要原因。另外，本研究表明，部分菌株還能在pH為3的條件下生長，體現出較強的耐酸能力。由此可見，從青藏高原極端環境中分離的乳酸菌具有相對較強的環境適應性和對環境脅迫的耐受性。

從目前的研究資料來看，食物魏斯氏菌和融合魏斯氏菌多分離自人類或其他動物[24-25]。研究表明，僅從形態和菌落特征方面是很難區分這兩種菌的，但可以從發酵的糖類區分二者，食物魏斯氏菌能發酵阿拉伯糖，但是不能發酵木糖和半乳糖，而融合魏斯氏菌不能發酵棉籽糖、阿拉伯糖和蜜二糖，但是能發酵核糖、半乳糖、麥芽糖和纖維二糖等[18,26]。雖然有研究表明，玉米(Zeamays)青貯飼料附著的融合魏斯氏菌乳酸菌可利用阿拉伯糖，但是其利用能力比較弱，分離的食物魏斯氏乳酸菌不能完全利用半乳糖發酵產酸[27]。但本試驗發現，由于高寒環境中魏斯氏乳酸菌對碳源的利用可能比其它環境中分離出的菌種更具廣泛性，因此從藏嵩草中分離的融合魏斯氏菌絕大部分菌株均能發酵阿拉伯糖，且分離鑒定的食物魏斯氏乳酸菌都可以利用半乳糖。明串珠菌屬廣泛分布于植物、泡菜、發酵乳制品和青貯料中。本研究分離的菌株都可以完全利用甘露糖、水楊苷、D-核糖、蜜二糖和半乳糖，而對照菌腸膜明串珠菌腸膜亞種對這些糖的利用效率不高[18,24]。從碳源利用的角度看，本研究中的腸膜明串珠菌腸膜亞種對碳源的利用比在其它環境中分離得到的菌株更強。

4 結論

通過對各菌種生理生化特性的比較研究發現，本研究分離得到的魏斯氏乳酸菌和明串珠菌對生長環境具有較強的耐受性，溫度在4～40 ℃條件時，大多菌株都能生長，有些菌株甚至能在50 ℃的條件下生長。在耐酸堿試驗中，本研究中的菌株表現出較強的耐酸堿性，當pH為3.0和9.5時有些菌株依舊能夠生長。本研究中分離出的食物魏斯氏乳酸菌可以發酵半乳糖，融合魏斯氏菌可以發酵甘露醇、密二糖和阿拉伯糖，這表明在利用糖源方面，高寒乳酸菌比常規乳酸菌更廣泛。因此，青藏高原極端環境中分離的乳酸菌不僅利用的糖源更廣泛，而且環境適應性和對環境脅迫的耐受性相對較強，這些特殊性有助于進一步進行青藏高原乳酸菌的開發應用研究。

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