沙門氏菌菌毛研究進展

朱春紅，孟 霞，厚華艷，龔建森，張江英，朱國強

（1.江蘇省家禽科學研究所，揚州 225125；2.揚州大學獸醫學院，揚州 225009）

菌毛是革蘭氏陰性菌菌體表面的絲狀蛋白附屬物，又稱柔毛、纖毛等，直徑為0.2～1.5 mm。沙門氏菌菌毛多由結構蛋白亞單位組成，具有抗原性，與沙門氏菌的致病性相關。本文以GenBank上已經公布的多株不同血清型沙門氏菌全基因組序列信息為參考，結合相關文獻，綜述不同血清型沙門氏菌菌毛操縱子編碼基因，分子結構特征及其在沙門氏菌進化、宿主嗜性、致病、感染擴散中的可能作用。

1 沙門氏菌菌毛操縱子基因分類

傳統的沙門氏菌菌毛分類主要依據其形態和紅細胞凝集反應性，但是在與環境以及宿主相互作用過程中，細菌基因組會發生堿基替換、基因轉移、染色體倒位，缺失或重組等變異現象，使得細菌遺傳信息發生變化，從而產生新的表型性狀，因此基于生物大分子（核酸和蛋白質序列）信息的分類方法則顯得相對客觀[1]。對已登錄GenBank的沙門氏菌全基因組序列進行比對分析，表明菌毛編碼基因操縱子廣泛存在于各種血清型的沙門氏菌基因組中，沙門氏菌基因組通常含有5～20種菌毛編碼基因操縱子，依據其可能的表達和組裝方式，菌毛主要分為下述三種類型:

1.1 伴侶蛋白-推進蛋白途徑類( Chaperone/usher pathway, CUP )菌毛CUP類菌毛即經過伴侶蛋白-推進蛋白途徑組裝和表達的菌毛，對于這種方式組裝與表達機制的菌毛國內外已經有了較為深入的研究。目前研究的大部分菌毛都通過這種機制表達。這類菌毛操縱子基因至少包括三個結構基因，菌毛亞單位蛋白編碼基因，伴侶蛋白編碼基因，推進蛋白編碼基因，有時還有其他亞單位編碼基因，如次要亞單位蛋白基因（通常表達于菌毛頂端的粘附素性亞單位），調控基因等。菌毛亞單位蛋白通過在N-末端產生信號肽序列的方式直接進入到細胞周質間隙，N-末端信號肽序列在轉運過程中被降解，菌毛結構亞單位蛋白在周質間隙中與伴侶蛋白結合避免非活性形式的聚集或者被相關蛋白酶降解，然后在推進蛋白的輔助作用下穿過外膜蛋白，正確組裝并成功表達于細菌表面。

研究者根據GenBank中已經共享的沙門氏菌全基因組信息，對推進蛋白編碼序列進行比對分析，進一步將CUP類菌毛分為以下6個亞類:δ型，α型，β型，γ型，κ型和π型（圖1）。分析圖1中列出的17株沙門氏菌菌株的全基因組序列，發現腸道沙門氏菌腸科亞種除亞利桑那沙門氏菌基因組僅含5個CUP類菌毛編碼基因簇外，其他腸科亞種沙門氏菌基因組中均含有11-13種不同CUP類菌毛編碼操縱子；邦戈爾沙門氏菌則含有8個CUP類菌毛編碼基因簇[2]；比對大腸桿菌參考菌株K-12株序列，發現其和腸道沙門氏菌腸科亞種菌株相似，同時分析到12種之多的CUP類菌毛編碼基因[3]。

1.2 成核沉淀途徑(nucleation-precipitation pathway)類菌毛沙門氏菌中，成核沉淀途徑類菌毛主要為細凝 集 性 菌 毛（thin aggregative fimbriae，Tafi）， 由操縱子基因agfDEFG、agfBA編碼和轉錄[5,6]，這類菌毛形態和其他菌毛不同，直徑3～4 nm，其在菌體表面呈現一種異聚體蛋白絲狀形態，由一個獨特的方式—成核沉淀方式組裝表達展呈于菌體表面。

圖1 沙門氏菌菌毛操縱子分類[4]Fig.1 Classifi cation of Salmonella fi mbriae

沙門氏菌Tafi菌毛和大腸桿菌卷曲菌毛（Curli菌毛）高度同源，目前對大腸桿菌Curli菌毛的組裝機制研究比較深入。大腸桿菌Curli菌毛同樣是由操縱子基因操縱子 csg（curli subunit genes）(csgDEFG、csgBA) 編碼和轉錄[7]，csgBA編碼的亞基CsgB和CsgA通過信號肽的方式分泌到周質中，CsgD調控csgBA的轉錄，CsgG是一種外膜脂蛋白，與CsgE結合協助CsgA和CsgB完成跨膜運轉；在沙門氏菌中，AgfA是Tafi菌毛的主要亞單位蛋白，其含有標準的信號肽序列，在AgfG亞單位的協同作用下通過細胞周質間隙，完成跨膜運轉[8]，次要亞單位蛋白AgfB，又稱為nucleator，與分泌出的AgfA單體成核沉淀成不溶性的β折疊結構[9]，在菌體表面形成淀粉纖維樣沉淀物[10]。成核沉淀方式與伴侶蛋白-推進蛋白方式最主要不同之處在于，CUP類菌毛是在周質間隙中菌毛亞基蛋白發生聚合，而Curli菌毛和Tafi菌毛組裝則發生在細菌外膜上。

1.3 Ⅳ型菌毛Ⅳ型菌毛是主要分布于革蘭氏陰性致病菌表面的一種強韌細絲狀纖毛，為纖毛蛋白的多聚體，多位于細菌細胞的一端。根據其主要亞單位蛋白的同源性，可以分為兩類:ⅣA型和ⅣB型。ⅣA型菌毛含有較短的先導氨基酸序列和成熟的氨基酸序列，其宿主范圍較廣，可分布于人類、其他哺乳動物、植物、真菌和各種細菌表面；ⅣB型菌毛氨基酸序列較長，只分布于腸道細菌表面。

分析比對已發表的沙門氏菌株全基因組信息發現，僅少數屬沙門氏菌含ⅣB型菌毛操縱子基因，如:邦戈爾沙門氏菌的sbeTABCDEFGHIP操縱子，傷寒沙門氏菌的pilM（N'，N）OPQRSTUV操縱子，B型副傷寒沙門氏菌和海德堡沙門氏菌基因組也含有類似的同源的操縱子序列[11,12]。

Ⅳ型菌毛的結構研究報道在銅綠假單胞菌和奈瑟琳球菌中較多。他們的組成成分和Ⅱ型分泌系統的成分有同源性，包括菌毛蛋白、前菌毛肽酶、有或無核苷結合基序的可溶性蛋白、膜內蛋白和形成寡聚圓環結構的外膜蛋白。Ⅳ型菌毛蛋白最初是由一個菌毛蛋白亞基開始形成，在這個基礎上結構前體蛋白經過前菌毛蛋白肽酶的裂解，前菌毛蛋白肽酶有雙重功能(生成菌毛蛋白結構和調節細菌外分泌系統)，他能同時使成熟菌毛蛋白的第一個氨基酸(苯丙氨酸或甲硫氨酸)甲基化。Ⅳ型菌毛亞基是在內膜周質中組裝形成，在聚集成菌毛蛋白纖維之前，菌毛蛋白分子通過N端高度保守的疏水性區域的氨基酸先附著在內膜上，傷寒沙門氏菌的菌毛亞基pilin通過普遍分泌方式（產生信號肽的分泌方式）轉運到周質中，并錨定在內膜上，向外膜拉伸形成完整的菌毛[13]。

2 菌毛基因操縱子的遺傳變異

通過對17株測序完成的沙門氏菌株全基因組序列比較發現，腸道沙門氏菌含有多達11～13種之多的菌毛操縱子基因，且每種沙門氏菌基本上都含有一種或多種標準的CUP類菌毛蛋白。雖然菌毛種類極富多樣性，但直系同源的沙門氏菌菌毛基因操縱子通常位于基因組序列中相似的位置，據報道，沙門氏菌一旦獲得某種菌毛操縱子基因序列，則能通過垂直遺傳和水平遷移（包括同源重組，轉染，轉導）等方式進行遺傳[4]。

序列信息分析表明bcf、fim、sth菌毛操縱子基因在沙門氏菌屬內高度保守，而lpf、peg、saf、stb、stc、std、ste、stf和sti這9種菌毛基因操縱子基因同源性能大于45%，但是其他菌毛操縱子基因同源性則小于45%[4]。

研究者所在實驗室通過PCR擴增方法檢測了D群部分沙門氏菌SEF14菌毛基因操縱子的變異情況，研究共檢測了18株雞白痢沙門氏菌、11株腸炎沙門氏菌以及1株都柏林沙門氏菌標準株sefA、sefD和sefR基因序列，結果發現sefA、sefD以及sefR基因在腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌中普遍存在，并和已發表的序列100%同源，但sefD和sefR基因在雞白痢沙門氏菌中或發生堿基缺失，或無相應PCR產物，說明SEF14菌毛基因操縱子在雞白痢沙門氏菌進化過程中發生了變異，這一變異很可能是雞白痢沙門氏菌和腸炎沙門氏菌同屬D群沙門氏菌，卻不能表達SEF14菌毛的原因之一[14]。

3 沙門氏菌菌毛生物學功能

多數致病菌富含多種菌毛結構，如腸道致病菌腸炎沙門氏菌。目前對多種菌毛結構的生物組裝及分泌機制研究較多，但對這些菌毛結構在沙門氏菌中的致病作用仍了解甚少。

3.1 CUP類菌毛沙門氏菌基因組中含有豐富的CUP類菌毛編碼基因操縱子序列，但對其表達產物—菌毛蛋白在病原菌與易感宿主之間的相互關系仍未能深入研究。目前研究最廣泛的I型菌毛，是由fim操縱子編碼的，在靜置條件下表達于所有的檢測的沙門氏菌血清型中。FimA是I型菌毛的主要蛋白亞基，形成菌毛的主干部分，對宿主趨性有影響，但關于FimA的功能還存在爭議[15,16]；FimH位于菌毛頂端，其氨基酸序列差異決定不同菌種或不同血清型的I型菌毛與不同宿主細胞特異性粘附。研究發現大腸桿菌FimH優先結合到膀胱上皮細胞，而沙門氏菌FimH結合腸細胞[16]。FimH在結合的特異性上的變化不受血清型限制,但是對相同血清型的菌株的FimH進行誘導會產生不同的結合特性。在鼠傷寒沙門氏菌中，存在高粘附性和低粘附性兩個FimH變種[15,17]，高粘附性變種FimH對人類上皮細胞系有更高的親和力，低粘附性變種FimH和腸炎沙門氏菌的FimH有同樣的結合特性，屬于甘露糖敏感型，體外實驗中能同時結合人膀胱上皮細胞系和人結腸上皮細胞系[17,18]，不同于低粘附性變種FimH，高粘附性變種FimH對不同細胞系的粘附能力差異較大[18]。

研究者所在實驗室正致力于限制性表達于腸炎沙門氏菌等D群沙門氏菌的SEF14菌毛的生物學功能探索，部分研究數據顯示SEF14菌毛能在優化的體外培養條件下表達。SEF14菌毛優化表達后，可以使活化的小鼠腹腔巨噬細胞對SEF14菌毛主要亞單位突變株吞噬作用增強，借助SEF14菌毛的作用，腸炎沙門氏菌能更好的作用于巨噬細胞并在巨噬細胞中存活[19]。

3.2 細凝集性菌毛細凝集性菌毛除了組裝方式和其他菌毛區別外，其還有一些獨特的生物學特性。細凝集性菌毛編碼基因在多種屬細菌中高度保守如:檸檬桿菌屬（Citrobacter），腸桿菌屬（Enterobacter），埃希氏菌屬（Escherichia），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）,沙門氏菌屬（Salmonella）和志賀氏桿菌屬（Shigella）[20]。細凝集性菌毛在沙門氏菌以及大腸桿菌中是生物膜形成的基質成分之一，細凝集性菌毛促進細菌在基質表面，特別是無生命物質表面，如玻璃、聚丙烯、聚氯乙烯等物質表面形成生物膜，細凝集性菌毛相互纏結，把鄰近的細菌聯接成小菌群，逐漸發育為生物膜[21]。另外，細凝集性菌毛能作為病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）被TLR2識別，啟動先天性免疫保護作用。最新的研究表明，TLR2能啟動宿主及病原源性的纖維淀粉樣結構物質的先天性免疫反應[22]。鼠傷寒沙門氏菌致?；啬c袢炎的試驗中，病菌侵襲后，機體對細凝集性菌毛淀粉樣蛋白的識別能啟動前炎性因子的生成和中性粒細胞的聚集[23]。

3.3 Ⅳ型菌毛目前關于Ⅳ型菌毛的生物學功能在假單胞菌屬和奈瑟菌屬研究相對較多，在沙門氏菌屬中的研究鮮見報道。革蘭氏陰性細菌在半固體表面如黏膜表面可有一種特有的運動形式，在黃黏球菌中這種運動稱為滑行運動，而在假單胞菌屬和奈瑟菌屬中的運動稱為蹭行運動。研究者運用鐳射顯微光鉗系統進行體外實驗發現奈瑟球菌通過Ⅳ型菌毛的伸縮運動完成在介質表面的運動，而其中PilT蛋白復合體起到了重要的作用[24]；相關研究還證明蹭行運動能激活宿主免疫應答反應，介導早期的前炎癥因子的釋放，如IL-8，IL-6等[25]。Ⅳ型菌毛能通過自聚集在靶組織表面形成微克隆菌群，這種特性和Ⅳ型菌毛介導的介質表面運動共同參與了細菌生物膜的形成。Kube等[25]用實時共聚焦掃描顯微鏡觀察發現銅綠假單胞菌會逐漸游弋形成蘑菇狀的生物膜，提示了Ⅳ型菌毛在生物膜形成中的作用。Ⅳ型菌毛還參與一些致病過程比如免疫逃避、DNA吸收、生物膜形成、微菌落形成、粘附等。傷寒沙門氏菌Ⅳ型菌毛通過囊性纖維化跨膜轉導調節子（CFTR）來完成附著和吸收，CFTR的水平與傷寒沙門氏菌的吸收效率相聯系。prePil結合到CFTR上介導傷寒沙門氏菌與腸上皮細胞的粘附。有趣的是，囊性纖維化的CFTR突變株△F508，小鼠粘膜下層細胞對突變株的吸收嚴重下降。帶有雜合子的突變株對傷寒沙門氏菌感染的敏感性降低[26-28]。上述研究均提示Ⅳ型菌毛在沙門氏菌屬相關血清型細菌中的重要生物學致病作用，有較高研究價值。

4 菌毛基因操縱子與宿主嗜性

沙門氏菌菌毛操縱子基因的多樣性分布可能與沙門氏菌的宿主嗜性相關[29]，爬行動物等冷血動物不具有免疫記憶能力，相應的冷血動物適應性沙門氏菌則含有較少種類的菌毛操縱子基因，如:亞利桑那沙門氏菌含有5種菌毛操縱子基因，邦戈爾沙門氏菌含有8種菌毛操縱子基因(見圖2)。

傷寒沙門氏菌以及甲乙丙三型副傷寒等血清型沙門氏菌是高度適應于人類的沙門氏菌，對其他動物不引起自然感染。對傷寒沙門氏菌的測序結果分析表明這一血清型沙門氏菌分化于5萬年前[30]。和引起局部腸炎的其他相近血清型沙門氏菌相比，傷寒沙門氏菌能導致感染宿主的全身性敗血癥反應[31]，且長期的膽囊帶菌。在此感染機制下，傷寒沙門氏菌表現為多樣性菌毛操縱子基因的失活，成為假基因，這一推論表現為傷寒沙門氏菌CT18株11個菌毛操縱子基因中7個演變為假基因，Ty2株則8個菌毛操縱子基因演變為假基因（圖2）。研究者所在實驗室對SEF14菌毛操縱子基因的遺傳變異分析發現，部分雞白痢沙門氏菌菌株SEF14菌毛亞單位編碼基因sefD演變為假基因，表明此遺傳變異可能與雞白痢沙門氏菌的專嗜性相關[14]。

這種宿主偏嗜性沙門氏菌中菌毛操縱子基因的失活為假基因是一種趨勢，但是也存在一些例外，如乙型副傷寒沙門氏菌一共11種菌毛操縱子基因，只有1個失活為假基因，其他10個仍是完整的菌毛操縱子基因。這一現象的可能解釋是B型副傷寒是出現較晚的宿主偏嗜性沙門氏菌[32]。上述研究表明，假基因的出現以及積累是宿主偏嗜性沙門氏菌利用菌毛操縱子基因失活以趨同方式適應單一宿主的模式[33]。

圖2 不同血清型沙門氏菌CUP類菌毛操縱子假基因的比例[4]Fig.2 Chaperone/usher fi mbriae repertoire pseudogene content amongst the analysed Salmonella serovars

5 展望

沙門氏菌菌毛操縱子基因的多樣性分布可能是不同血清型沙門氏菌適應環境的一種反應，對不同菌毛在沙門氏菌致病及傳播過程中的作用，對不同菌毛的鑒定及功能解析等研究還有待加強。相信隨著分子生物學研究技術的不斷發展，沙門氏菌菌毛的結構和功能研究也會不斷深入，菌毛在沙門氏菌特異性檢測與預防控制方面將會發揮極其重要的作用。

[1]衣美英, 朱萬孚, 劉樹林.基因組結構在細菌種系發育研究中的應用[J].中華微生物學和免疫學雜志, 2003,23(12)： 995-998.

[2]Nuccio S P, B-umler A J.Evolution of the chaperone/usher assembly pathway： fimbrial classification goes Greek [J].Microbiol Mol Biol Rev, 2007, 71(4)： 551-575.

[3]Marchler-Bauer A, Bryant S H.CD-Search： protein domain annotations on the fly [J].Nucleic Acids Res,2004, 32(Web Server issue)： W327-331.

[4]Steffen Porwollik.Salmonella： From Genome to Function[M].//Sean-Paul Nuccio, Thomson N R, Fookes M C,et al.Fimbrial signature arrangements in Salmonella.Caister Academic Press; 1 edition (January 1, 2011).

[5]Collinson S K, Em-dy L, Müller K H,et al.Purification and characterization of thin, aggregative fimbriae from Salmonella enteritidis [J].J Bacteriol, 1991, 173(15)：4773-4781.

[6]Collinson K S, Doig P C, Doran J L,et al.Thin aggregative fimbriae mediate binding of Salmonella enteritidis to fibronectin[J].J Bacteriol, 1993; 175(1)： 12-18.

[7]Olsén A, Jonsson A, Normark S.Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli[J].Nature, 1989, 338(6217)： 652-655.

[8]Robinson L S, Ashman E M, Hultgren S J,et al.Secretion of curli fibre subunits is mediated by the outer membrane-localized CsgG protein[J].Mol Microbiol,2006, 59(3)： 870-881.

[9]Shewmaker F, McGlinchey R P, Thurber K R,et al.

The functional curli amyloid is not based on in-register parallel beta-sheet structure[J].J Biol Chem, 2009,284(37)： 25065-25076.

[10]Chapman M R, Robinson L S, Pinkner J S,et al.Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation[J].Science, 2002, 295(5556)： 851-855.

[11]Parkhill J, Dougan G, James K D,et al.Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18[J].Nature, 2001, 413(6858)： 848-852.

[12]Yoshida T, Kim S R, Komano T.Twelve pil genes are required for biogenesis of the R64 thin pilus[J].J Bacteriol, 1999, 181(7)： 2038-2043.

[13]Wolfgang M, van Putten J P, Hayes S F,et al.Components and dynamics of fiber formation define a ubiquitous biogenesis pathway for bacterial pili [J].EMBO J, 2000, 19(23)： 6408-6418.

[14]Zhu C H, Wu J, Chen W W,et al.Difference and variation of the sef14 operon gene clusters in S.pullorum[J].J Basic Microbiol, 2010, 50(Suppl 1)： S120-123.

[15]Guo A, Cao S, Tu L, Chen P,et al.FimH alleles direct preferential binding of Salmonella to distinct mammalian cells or to avian cells [J].Microbiology, 2009, 155(Pt 5)：1623-1633.

[16]Thankavel K, Shah A H, Cohen M S,et al.Molecular basis for the enterocyte tropism exhibited by Salmonella typhimurium type 1 fimbriae [J].Biol Chem, 1999,274(9)： 5797-5809.

[17]Boddicker J D, Ledeboer N A, Jagnow J,et al.Differential binding to and biofilm formation on, HEp-2 cells by Salmonella enterica serovar Typhimurium is dependent upon allelic variation in the fimH gene of the fim gene cluster [J].Mol Microbiol, 2002, 45(5)：1255-1265.

[18]Kisiela D, Laskowska A, Sapeta A,et al.Functional characterization of the FimH adhesin from Salmonella enterica serovar Enteritidis [J].Microbiology, 2006,152(Pt 5)：1337-1346.

[19]Chunhong Zhu, Juan Wu, Hassan Hussein Musa,et al.Construction of S.enteritidis SefA and SefD Mutants and their Role in Invasion and Survival to Host Cell.Microbiological Society of Korea's 50th Anniversary International Symposium on Microbiology 2009 May 28-30, 2009, Jeju Island, Korea.

[20]Zogaj X, Bokranz W, Nimtz M,et al.Production of cellulose and curli fimbriae by members of the family Enterobacteriaceae isolated from the human gastrointestinal tract [J].Infect Immun, 2003, 71(7)：4151-4158.

[21]R mling U, Bokranz W, Rabsch W,et al.Occurrence and regulation of the multicellular morphotype in Salmonella serovars important in human disease [J].Int J Med Microbiol, 2003, 293(4)： 273-285

[22]Tükel C, Wilson R P, Nishimori J H,et al.Responses to amyloids of microbial and host origin are mediated through toll-like receptor 2[J].Cell Host Microbe, 2009,6(1)： 45-53.

[23]Tükel C, Raffatellu M, Humphries A D,et al.CsgA is a pathogen-associated molecular pattern of Salmonella enterica serotype Typhimurium that is recognized by Toll-like receptor 2[J].Mol Microbiol, 2005, 58(1)： 289-304.

[24]Maier B.Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria [J].Cur Opin Microbiol, 2005, 8(3)：344-349.

[25]Kube D, Sontich U, Fletcher D,et al.Proinflammatory cytokine responses to P.aeruginosa infection in human airway epithelial cell lines [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2001, 280(3)： L493-502.

[26]Pier G B, Grout M, Zaidi T,et al.Salmonella typhi uses CFTR to enter intestinal epithelial cells [J].Nature.1998,93(6680)： 79-82.

[27]Xu X F, Tan Y W, Lam L,et al.NMR structure of a type IVb pilin from Salmonella typhi and its assembly into pilus[J].J Biol Chem, 2004, 279(30)： 31599-31605.

[28]Tsui I S, Yip C M, Hackett J,et al.The type IVB pili of Salmonella enterica serovar Typhi bind to the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator [J].Infect Immun, 2003, 71(10)： 6049-6050.

[29]Norris T L, B-umler A J.Phase variation of the lpf operon is a mechanism to evade cross-immunity between Salmonella serotypes [J].Proc Natl Acad Sci U S A.1999, 96(23)： 13393-13398.

[30]Kidgell C, Reichard U, Wain J,et al.Salmonella typhi,the causative agent of typhoid fever, is approximately 50,000 years old [J].Infect Genet Evol, 2002, 2(1)： 39-45.

[31]Kingsley R A, B-umler A J.Host adaptation and the emergence of infectious disease： the Salmonella paradigm[J].Mol Microbiol, 2000, 36(5)： 1006-1014.

[32]Selander R K, Beltran P, Smith N H,et al.Evolutionary genetic relationships of clones of Salmonella serovars that cause human typhoid and other enteric fevers [J].Infect Immun, 1990, 58(7)： 2262-2275.

[33]Holt K E, Thomson N R, Wain J,et al.Pseudogene accumulation in the evolutionary histories of Salmonella enterica serovars Paratyphi A and Typhi [J].BMC Genomics, 2009, 10： 36.