生物小分子釩配合物抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性研究

李鵬宇 盧麗萍

(山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，太原 030006)

0 引 言

釩化合物具有胰島素樣活性[1]，其作為潛在的治療糖尿病藥物引起了生物無機化學研究者的廣泛興趣。研究發現釩的無機鹽和釩配合物有降糖作用，但釩的無機鹽具有較低的口服吸收能力，對身體也有一定的毒副作用。釩配合物(也稱有機釩化合物)比簡單的無機鹽脂溶性好、細胞滲透能力強，其生物利用度較高，達到同樣療效所需劑量小，相對降低了其毒性。研究報道已篩選出一系列新的氧釩配合物如雙麥芽酚氧釩(BMOV)，乙酰丙酮氧釩[VO(acac)2]，吡啶二羧酸氧釩[VO(pic)2]等作為潛在的治療糖尿病藥物，試圖替代無機釩鹽，以提高釩的生物利用度[2-4]。

釩化合物的治療糖尿病活性機理研究表明其對蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)的活性抑制有一定的關系[5]。近些年的研究指出蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)通過使胰島素受體去磷酸化，負向調節胰島素信號傳導。PTP1B的缺失能使小鼠抵抗高能量食物誘導的高血糖和肥胖癥[6]。因此，PTP1B抑制劑的研究可望篩選出高效低毒的抗糖尿病和抗肥胖癥的新藥物。篩選針對PTP1B的高效、專一的抑制劑作為治療糖尿病的藥物吸引了眾多的研究學者[7-8]。為了更進一步篩選釩配合物類抗糖尿病藥物，本課題組在前人的研究基礎上探討了各種不同結構的釩配合物對PTP1B抑制的選擇性，以期篩選以PTP1B為靶標的高效低毒的潛在釩配合物抗糖尿病藥物，研究顯示并非所有的釩配合物都對PTP1B具有好的抑制作用和選擇性，其配體結構能夠明顯影響其對PTP1B的抑制強度和選擇性[9-18]?？紤]到釩配合物進入體內后或者保留其原有的結構，或者發生解離后與體內的各種大、小有機分子結合形成新的配合物作用于體內的靶分子，為此，我們曾合成與表征谷氨酸氧釩配合物，檢測了它對蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用[10]。在此基礎上，本文探討了體內一系列有機小分子配體與氧釩離子結合形成的生物小分子釩配合物對蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用和選擇性。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

對硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)購自上海西寶生物有限公司；MOPS[3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]購自北京華美生物有限公司；所用其它試劑均為國內市售分析純。Hewlett-Packard 8453 UV-Vis光譜儀記錄紫外光譜；BIO-RAD550 USA酶標儀用于酶活性測試；PHS-3TC型pH計測試pH。

1.2 實驗材料

PTP1B、TCPTP、HePTP和 SHP-1的表達與純化見文獻[9,19-20]。4種酶的重組表達質粒菌株由吉林大學生命科學院Edmond H.Fischer信號傳導實驗室付學奇教授提供[21-22]。具體表達和純化步驟基本相似，以PTP1B為例說明如下：挑取單個克隆菌接種于5 mL Luria-Bertani(LB)液體培養基中 (含100 μmol·L-1Amp，34 μmol·L-1Cam，下同)，置于 37 ℃振蕩培養過夜，擴大培養于1 000 mL LB液體培養基中至 OD600=0.6，加入終濃度為 100 μmol·L-1，IPTG(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside)，使其在 37 ℃培養6 h后離心收集菌體。取10 g菌體用PBS洗滌，加 100 mL 提取緩 沖液 (25 mmol·L-1Tris-HCl，10 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-12-mercaptoethanol(2-ME)，0.002% phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF))， 超聲波破碎，13 000 r·min-1離心 45 min，收集上清。將上清上樣于用Buffer Q(25 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.5，2 mmol·L-12-ME，1 mmol·L-1EDTA)平衡過的 FFQ 柱上，用含 0.1 mol·L-1NaCl的Buffer Q洗滌，除去雜蛋白，然后用含0.2 mol·L-1NaCl的Buffer Q洗脫，得到活性組分。用Buffer Q平衡S-100層析柱，將洗脫得到的活性組分除鹽、濃縮后，上S-100柱，收集活性峰，濃縮；用MOPS buffer(20 mmol·L-1MOPS，500 mmol·L-1NaCl，pH7.2)透析，以牛血清白蛋白為標準，Bradford法測定蛋白濃度。

1.3 釩配合物溶液及紫外光譜

在生物體內，相對金屬離子而言，一些小的生物配體分子往往是過量的。為模擬體內狀態，本實驗選取生物小分子配體與VO（Ⅱ）離子的物質的量之比為20∶1，攪拌均勻，配制成水溶液，用NaOH調節pH至7.2左右，反應過夜，備用。

運用紫外可見光譜在MOPS（pH=7.2）緩沖溶液中測定生物小分子對VO（Ⅱ）離子的滴定曲線，確定溶液中主要存在的配合物物種。

1.4 氧釩配合物對蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制作用

底物對硝基苯磷酸二鈉鹽(p-NPP)被磷酸酶水解的產物對硝基苯酚(p-NP)在405 nm處有強吸收峰[12]，其摩爾吸光系數為 1.78×104L·mol-1·cm-1。配合物對PTP1B、TCPTP、HePTP和SHP-1的抑制作用在 pH 7.20 緩沖溶液 (20 mmol·L-1MOPS，50 mmol·L-1NaCl)體系中進行；即將不同濃度 (1.0×10-2,10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9mol·L-1) 的釩配合物 10μL加入 82μL的酶溶液中，37℃反應 30 min，加入 2 μL 100 mmol·L-1p-NPP 啟動酶反應，20 min后用6μL 2 mol·L-1NaOH終止反應。根據反應體系對p-NPP水解產生p-NP在405 nm處的光吸收變化計算半數抑制濃度IC50值。半數抑制濃度IC50的計算見文獻[9-10]。

2 結果與討論

2.1 生物小分子與氧釩離子比為20∶1的溶液中氧釩配合物的配合比分析

任何金屬配合物進入人體，都可能有部分金屬配合物與體內的有機小分子發生配體交換，在體液環境形成新的配合物，而這些有機小分子相對于金屬離子而言是極度過量的。為了了解生物體內的這種配體與金屬離子濃度相差甚大的環境體系中金屬離子與配體作用形成配合物的情況，20世紀80、90年代Costa等曾探討過高物質的量之比的各種氨基酸:氧釩離子溶液中形成的氧釩配合物的物種。在中性pH值條件下，氨基酸氧釩配合物主要以配體:氧釩為 2∶1 的形式存在[23-29]。Lodyga-Chruscinska 等對檸檬酸、酒石酸等在配體與氧釩離子物質的量之比為100的溶液條件下形成的氧釩配合物物種進行了分析，結果表明在中性pH條件下，檸檬酸與氧釩離子配合形成1∶1的配合物，而酒石酸與氧釩離子配合形成2∶1的配合物[30]。為了模擬體內環境，本實驗在分析生物小分子釩配合物抑制蛋白酪氨酸磷酸酶活性時采用了生物小分子配體與氧釩離子的物質的量之比為20∶1混合溶液，并應用紫外光譜滴定法檢測了生物小分子配體與氧釩離子的物質的量之比為20:1的在pH=7.2的MOPS緩沖溶液體系中形成氧釩配合物的物種，以苯丙氨酸和蘋果酸為代表說明如圖1。圖1(左)表明硫酸氧釩在244 nm處有吸收峰，苯丙氨酸的加入使此處的吸收峰不斷加強，但當苯丙氨酸與硫酸氧釩的物質的量之比接近2∶1時，244 nm處的吸收峰增加明顯減速出現拐點，而且隨著苯丙氨酸與硫酸氧釩的物質的量之比增加即使增加到20∶1，244 nm處的吸收峰的強度幾乎不變，表明苯丙氨酸與氧釩離子在苯丙氨酸與硫酸氧釩的物質的量之比為2∶1到20∶1溶液中配合形成了2∶1的配合物。257 nm處吸收峰的變化同樣說明苯丙氨酸與氧釩離子配合形成了2:1的配合物。圖1(右)顯示蘋果酸與氧釩離子配合則形成1∶1的配合物。本實驗測定的10種小分子配體與氧釩離子形成配合物的情況中，氨基酸如苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸與氧釩離子配合都形成2∶1的配合物，與Costa等研究的結果一致,也與我們合成的谷氨酸釩配合物的結構一致[10]，而抗壞血酸及多羧酸如檸檬酸、蘋果酸、氨三乙酸與氧釩離子配合形成1∶1的配合物，檸檬酸與氧釩的結合比與Lodyga-Chruscinska等的研究結果一致。這些結果說明氨基酸、多羧酸以及抗壞血酸在生物體內能與氧釩離子配合形成配合物。

圖1 苯丙氨酸（左）與蘋果酸（右）滴定硫酸氧釩的紫外圖譜,插圖顯示苯丙氨酸(蘋果酸)與氧釩分別形成2∶1與1∶1配合物Fig.1 UV-Vis spectra of the titration of Phe(left)and malic acid(right)to VOSO4

2.2 生物小分子氧釩配合物對PTP1B的抑制作用

本實驗檢測了各種生物小分子及其氧釩配合物對PTP1B的抑制作用。結果表明這些生物小分子大部分對PTP1B基本沒有抑制作用，只有少數幾種有微弱的抑制作用：如檸檬酸、蘋果酸等對PTP1B抑制的IC50約為100μmo·L-1。 而與VOSO4配合形成穩定的氧釩配合物后對PTP1B的抑制作用明顯提高，結果見表1。從表1中可以看出檢測19種生物小分子氧釩配合物中有14種的IC50值在0．12～0．63 μmol·L-1之間，表現強烈的抑制作用，與此前報道的氧釩配合物相比其抑制作用屬于較強的類型[9-14]。再者，化合物[VO(Phe)2]表現最強的抑制作用，IC50值為0．07 μmol·L-1。 而 [VO(Arg)2]、 [VO(Oxalate)]、 [VO(Nitrilotriacetate)]和[VO(Citrate)]則呈現較弱的抑制，IC50值分別為 1．05、1．41、9．90 和 21．5 μmol·L-1。說明氧釩配合物中配體的結構同樣影響氧釩配合物抑制PTP1B的效果，與其它配體報道的氧釩配合物研究的結論一致[9-15]。

表1 生物小分子配體氧釩配合物對PTP1B的抑制作用Table 1 PTP1B inhibition of vanadium-bioligand compounds

2.3 生物小分子氧釩配合物對PTP酶抑制作用的選擇性

在對PTP1B抑制作用研究的基礎上，選取了6 種 配 合 物[VO(Arg)2]、[VO(Tyr)2]、[VO(Phe)2]、[VO(Malate)]、[VO(Lactate)]和[VO(Citrate)]氧釩配合物進行PTPs的選擇性抑制研究，結果列于表2?？偟膩碚f，對PTP1B抑制作用較強的配合物對其它酶的抑制作用也較強，而對PTP1B抑制作用較弱的配合物對其它酶的抑制作用相對也較弱，但它們的選擇性卻明顯不同。[VO(Citrate)]雖然抑制能力較弱，但對SHP-1的抑制能力明顯強于對 PTP1B、TCPTP和HePTP的抑制作用。它對SHP-1的抑制作用 (IC50=1．15 μmol·L-1)分別是對 PTP1B、TCPTP 和 HePTP 的約20、24和500倍。[VO(Arg)2]對4種酶的抑制作用相差不大，IC50值在 1．05～3．67 μmol·L-1，僅 2～3 倍。[VO(Tyr)2]對PTP1B、HePTP和SHP-1的抑制作用很強，IC50分別為 0．18、0．63 和 0．31 μmol·L-1， 而對TCPTP 的抑制作用較弱，IC50為 1．37 μmol·L-1。 [VO(Phe)2]表現出對PTP1B和TCPTP的強烈抑制(IC50，0．07 和 0．06 μmol·L-1)而對 HePTP 和 SHP-1 的抑 制 作 用 稍 弱(IC50=0．19 和 0．17 μmol·L-1)。[VO(Malate)]對HePTP和SHP-1的抑制作用非常強(IC50=0．07 和 0．07 μmol·L-1)， 是對 PTP1B 和 TCPTP抑制作用的6～7倍。[VO(Lactate)]對TCPTP有較好的選擇性(IC50=0．11 μmol·L-1)，其抑制作用分別是對PTP1B、HePTP和SHP-1的4、40和10倍。本課題組曾檢測過不同結構的氧釩配合物對蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制的選擇性，如谷氨酸氧釩配合物對PTP1B、TCPTP、HePTP和SHP-1的抑制幾乎沒有選擇型[10]，而席夫堿以及雙胍類氧釩配合物對PTP1B的抑制表現一定的選擇性[9,11,13-14]。這些生物小分子氧釩配合物蛋白酪氨酸磷酸酶抑制作用進一步說明配體的結構不僅影響氧釩配合物對蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制效率同時也影響其選擇性。

表2 生物小分子配體氧釩配合物對PTP酶抑制的選擇性Table 2 PTPs inhibition(IC50)of selected oxovanadium compounds(mol·L-1)

3 結 論

本實驗研究顯示生物有機小分子配體與氧釩離子比為 20∶1 的條件下能形成 2∶1 或 1∶1 的氧釩配 合物，其中大部分生物小分子氧釩配合物對PTP1B表現強烈的抑制作用，化合物 [VO(Phe)2]表現最強的抑制作用，而[VO(Arg)2]、[VO(Oxalate)]、[VO(Nitrilotriacetate)]和[VO(Citrate)]則呈現較弱的抑制。對不同PTP的選擇性抑制作用表明對PTP1B抑制作用較強的配合物對其它酶的抑制作用也較強，而對PTP1B抑制作用較弱的配合物對其它酶的抑制作用相對也較弱，但選擇性卻有不同。

這些結果提示，如果氧釩配合物用作抗糖尿病藥物或者糖尿病患者在食用富釩食品用于輔助治療糖尿病時，可以考慮在食物中多攝取苯丙氨酸以及減少食用富含檸檬酸、精氨酸、草酸之類的食品，或許能提高氧釩的利用率，增加其藥效。

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