胃泌素促進胃癌細胞的遷移和侵襲*

劉 駿, 周建獎,2△, 趙 艷, 謝 淵

(貴陽醫學院 1分子生物學重點實驗室， 2附屬醫院檢驗科， 貴州 貴陽550004)

·短篇論著·

胃泌素促進胃癌細胞的遷移和侵襲*

劉 駿1, 周建獎1,2△, 趙 艷1, 謝 淵1

(貴陽醫學院1分子生物學重點實驗室，2附屬醫院檢驗科， 貴州 貴陽550004)

目的研究胃泌素在胃癌細胞遷移和侵襲中的作用。方法用細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移和侵襲實驗檢測10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理后胃癌細胞AGS和SGC-7901遷移和侵襲能力的變化， MTT法檢測細胞增殖能力， ELISA法檢測細胞上清液中基質金屬蛋白酶2(MMP- 2)的含量。結果10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理胃癌細胞后，細胞遷移和侵襲能力增強。對照組、10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素組AGS細胞平均遷移數分別為56.0、88.1和106.4 /view，SGC-7901細胞平均遷移數分別為52.8、91.0和113.3 /view， AGS細胞平均侵襲數分別為78.4、118.7和141.6 /view，SGC-7901細胞平均侵襲數分別為87.3、124.6和147.4/view(均P<0.01)；100 nmol/L胃泌素組細胞遷移和侵襲能力均高于10 nmol/L組(P<0.05)；胃泌素處理后細胞的增殖率及MMP- 2的分泌量也顯著增加(P<0.05)。結論胃泌素通過促進MMP- 2的分泌以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的遷移和侵襲能力，可能是體內胃癌細胞增殖、侵襲和轉移的重要機制之一。

胃泌素； 胃腫瘤； 基質金屬蛋白酶2

胃癌是嚴重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，其致死率居全球所有惡性腫瘤死亡的第2位[1]。迄今為止，胃癌的發病機制尚不清楚，近年的研究表明，胃癌的發生與胃腸道激素的表達異常有關，胃泌素(gastrin)即為其中重要的一種。胃泌素是一種胃腸肽激素，具有促進胃酸分泌等生理功能。但是近年的研究發現，病理情況下胃泌素能促進胃腸癌、胰腺癌及肝癌等胃腸道惡性腫瘤細胞的增殖[2- 4]，從而提出胃腸道腫瘤與胃泌素自分泌環假說密切相關，即胃腸道腫瘤細胞既能分泌胃泌素，又能表達胃泌素受體(又稱為膽囊收縮素B受體，cholecystokinin B receptor，CCKB受體)，胃泌素與細胞膜上的CCKB受體結合后，促進胃腸道腫瘤的發生發展[5]。但是目前胃泌素與胃癌的研究主要集中在細胞的增殖方面，與胃癌細胞侵襲轉移的關系尚未見報道。本研究用不同濃度的胃泌素處理胃癌細胞，研究胃泌素對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，為胃癌轉移的基礎研究提供理論依據。

材 料 和 方 法

1材料

人胃癌細胞株AGS(ATCC: CRL-1739TM)和SGC-7901由本實驗室保存；人胃泌素(human gastrin-17，G-17)和MTT(Sigma)；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)ELISA試劑盒和基質膠(R&D)；Transwell小室(Corning)；胎牛血清(Gibco)；改良型RPMI-1640培養基和雙抗(HyClone);DMSO(Ruitaibio)；RT-PCR試劑盒(天根生物)；其余試劑為國產分析純。

2方法

2.1細胞培養及胃泌素處理 人胃癌細胞株AGS和SGC-7901分別培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于37 ℃、5% CO2條件下培養。分別用終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理細胞，培養6～8 d后備用，所有實驗均以未經胃泌素處理的細胞為對照組。

2.2細胞劃痕實驗 于12 孔培養板中接種上述細胞，細胞數為5×105cells/well，過夜培養。細胞鋪滿后，用細胞刮通過孔中心劃一條寬度相等的橫行細胞刮除帶，吸掉含有刮除細胞的培養液，分別加入含終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素的培養液400 μL/well，37 ℃、5% CO2培養，于0 h和培養24 h后倒置顯微鏡下拍照，實驗重復3次。

2.3Transwell小室細胞侵襲實驗 預冷的無血清RPMI-1640培養液以1∶6體積稀釋液態基質膠，于24孔培養板中Transwell小室的上室加稀釋后基質膠40 μL，37 ℃孵育6 h。吸盡基質膠表面的液體，加入70 μL無血清RPMI-1640培養液，37 ℃孵育30 min。用含0.1%胎牛血清的RPMI-1640培養液稀釋細胞到108～109cells/L。上室中加入200 μL稀釋后的細胞，下室加含30%胎牛血清的RPMI-1640培養液600 μL，并于上、下室內加胃泌素，使之終濃度分別為10 nmol/L和100 nmol/L。37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h后，擦掉上室中基質膠上的細胞，用1%PBS洗滌3遍，將小室置于4%多聚甲醛中固定20 min，0.1%結晶紫染色20 min，洗滌3遍，顯微鏡下隨機選取10個視野，在400倍下計數侵襲到下室的細胞數，計算每個視野的平均侵襲細胞數，實驗重復3次。

2.4Transwel小室細胞遷移實驗 Transwell小室遷移實驗除上室中不加基質膠、細胞懸液的密度為107～108cells/L、下室中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液外，其余方法同Transwell小室侵襲實驗，最后計算平均遷移細胞數，實驗重復3次。

2.5MTT實驗 96孔培養板中接種細胞5 000 cells/well，加入胃泌素，使之終濃度為10 nmol/L和100 nmol/L，設8個復孔，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 d，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續培養4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標儀測A570，計算細胞的相對增殖率，相對增殖率(%)=A570實驗組/A570對照組×100%。

2.6ELISA實驗 用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理細胞，于收集上清液前12 h換成僅含胃泌素而不含血清的RPMI-1640培養液，上清液離心后用Bradford定量蛋白濃度， ELISA試劑盒檢測MMP- 2含量，按說明書操作。

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析， 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1胃泌素對胃癌細胞增殖能力的影響

如圖1所示， 10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，細胞的增殖能力顯著增強，差異有統計學意義(P<0.01)。

2胃泌素對胃癌細胞遷移能力的影響

用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，細胞的遷移速度快于對照組，見圖2。遷移到Transwell下室的細胞數也多于對照組,結晶紫染色計數結果顯示10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理組的平均遷移細胞數高于對照組 (P<0.01)， 100 nmol/L處理組也高于10 nmol/L處理組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 1. The proliferation rates of AGS and SGC-7901 cells determined by MTT assay. Mean±SD.n=8.**P<0.01vs0 nmol/L.

圖1MTT法檢測AGS和SGC-7901細胞的增殖率

Figure 2. The migration of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by wound-healing assay (×100).

圖2細胞劃痕實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的遷移

3胃泌素對胃癌細胞侵襲能力的影響

用10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，穿透Transwell上室基質膠及聚碳酸酯膜，侵襲到下室的細胞數顯著高于對照組細胞(P<0.01)，且隨胃泌素濃度的增加，侵襲細胞數也增加 (P<0.05)，見圖4。

Figure 3. The migration of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by Transwell assay (crystal violet staining，×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 nmol/L;##P<0.05vs10 nmol/L.

圖3Transwell小室實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的遷移及其細胞計數結果

4胃泌素增加胃癌細胞MMP-2分泌

10 nmol/L和100 nmol/L胃泌素處理AGS和SGC-7901細胞后，培養上清液中MMP- 2濃度高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

討 論

胃癌轉移是影響患者療效和預后的關鍵因素，亦是導致胃癌患者死亡的主要原因，而胃泌素與胃癌發生密切相關。有研究證實胃泌素的表達隨著腫瘤分化程度的降低而顯著增多，從而促進腫瘤細胞的生長，并與腫瘤的淋巴結轉移有相關性[2-5]。胃癌轉移是一個復雜的生物學過程，主要通過直接蔓延、淋巴道轉移、血行轉移和種植轉移方式發生，其中胃癌細胞穿越基底膜在胃癌轉移的過程中至關重要。Burkitt等[6]研究表明，胃泌素可通過MAPK 依賴性信號途徑使MMP表達水平升高，而MMP對細胞外基質及基底膜的降解效應促進了胃癌細胞侵襲及轉移。Takaishi等[7]在研究幽門螺桿菌感染、胃泌素及胃癌的關系指出，幽門螺桿菌感染相關性胃癌的發生發展中，胃泌素是其輔助因子。本課題組前期研究也發現：經幽門螺桿菌毒素相關蛋白CagA干預后的胃癌細胞株AGS、SGC-7901中，CagA上調胃泌素基因的表達，進一步研究發現胃癌標本中淋巴結轉移組胃泌素基因的表達水平是原發腫瘤的42倍，由此推測上調的胃泌素表達可能與胃癌轉移密切相關[8-9]。

Figure 4. The invasion of SGC-7901 and AGS cells after gastrin treatment determined by Transwell assay (crystal violet staining,×400).Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 nmol/L;##P<0.05vs10 nmol/L.

圖4Transwell小室實驗檢測胃泌素處理后SGC-7901和AGS細胞的侵襲及其細胞計數結果

表1胃泌素對胃癌細胞分泌MMP-2的影響

Table 1. Effects of gastrin on the secretion of MMP- 2 in gastric cancer cells [mg/(g protein).Mean±SD.n=6]

GroupAGScellsSGC-7901cellsControl65.609±4.74082.328±1.97010nmol/Lgastrin76.291±3.213*90.357±3.310*100nmol/Lgastrin72.733±1.999*88.263±0.531*

*P<0.05vscontrol group.

Transwell 小室實驗和細胞劃痕實驗已被國內外眾多學者用于腫瘤細胞遷移和侵襲的研究[10]。本研究首先通過細胞劃痕和Transwell小室遷移實驗發現經胃泌素處理后，細胞遷移能力顯著增強，Transwell下室中遷移細胞數顯著高于對照組的細胞數，且隨著胃泌素濃度的增高，細胞遷移數相應增加，說明胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的遷移能力。隨后本研究又通過Transwell小室侵襲實驗證實，經10 nmol/L與100 nmol/L胃泌素處理胃癌細胞后，Transwell下室中侵襲細胞數顯著高于未經胃泌素處理的細胞，且隨胃泌素濃度的增加侵襲細胞數也增加，說明胃泌素能增強胃癌細胞的侵襲能力。本研究還發現胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞的增殖能力，為細胞的遷移和侵襲提供細胞來源。

胃癌細胞發生轉移的首要條件是穿越細胞外基質和基底膜，而MMPs等多個因子參與了該過程。MMPs屬于鋅依賴性蛋白酶超家族，它們能降解內皮細胞外基質及血管基底膜，促進腫瘤的侵襲及轉移。其中MMP- 2可降解細胞外基質和血管基膜的主要成分Ⅳ型膠原，使腫瘤細胞易于脫離癌細胞巢，進出血管從而促進腫瘤的侵襲、轉移。有學者的研究發現，MMP- 2的表達與淋巴結的轉移和腫瘤的分期呈正相關[11]。本研究顯示胃泌素以劑量依賴的方式增強胃癌細胞分泌MMP- 2能力，可能是胃泌素促進胃癌細胞在體外遷移和侵襲的重要機制。也有學者發現隨著胃泌素作用時間的延長和劑量的增加，細胞中MMP-7的基因表達量也隨之上調，進而推測胃泌素可利用該機制促進胃癌細胞轉移[12]。

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Gastrinpromotesthemigrationandinvasionofgastriccancercells

LIU Jun1, ZHOU Jian-jiang1, 2, ZHAO Yan1, XIE Yuan1

(1KeyLaboratoryofMolecularBiology,2ClinicalLaboratoryofAffiliatedHospital,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China.E-mail:jianjiangzhou@sina.cn)

AIM: To study the effects of gastrin on the migration and invasion of gastric cancer cellsinvitro.METHODSThe migration and invasion of gastric cancer AGS and SGC-7901 cells after treated with gastrin at concentrations of 10 nmol/L and 100 nmol/L were studied by wound-healing assay and Transwell migration and invasion assay. The cell proliferation was analyzed by MTT colorimetric method. The concentration of matrix metalloproteinase 2 (MMP- 2) in the culture medium was detected by ELISA. The AGS and SGC-7901 cells without treating with gastrin served as control cells.RESULTSCompared with the control cells, the migration and invasion of AGS cells and SGC-7901 cells were significantly increased after treated with gastrin at concentrations of 10 nmol/L and 100 nmol/L. In control, 10 nmol/L gastrin and 100 nmol/L gastrin groups, the mean numbers of the migrating cells were 56.0, 88.1 and 106.4/view in AGS cells and 52.8, 91.0 and 113.3/view in SGC-7901 cells, and the mean numbers of the invasive cells were 78.4, 118.7 and 141.6/view in AGS cells and 87.3, 124.6 and 147.4/view in SGC-7901 cells, respectively. The numbers of the migrating cells and invasive cells in 100 nmol/L gastrin group were higher than those in 10 nmol/L gastrin group. The cell proliferation rate and the concentration of MMP- 2 in the culture medium in gastrin treatment groups were higher than those in control group.CONCLUSIONGastrin promotes the migration and invasion of gastric cancer cells in a dose-dependent manner by increasing the MMP- 2 secretion, which may be the key mechanism in the proliferation, invasion and metastasis of the cancer cellsinvivo.

Gastrin; Stomach neoplasms; Matrix metalloproteinase 2

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.027

1000- 4718(2013)04- 0730- 05

2012- 10- 27

2013- 03- 18

國家自然科學基金資助項目(No. 31060122)；貴州省科技攻關計劃基金資助項目(No. 黔科合SY字[2011]3067號)；貴州省科學技術基金資助項目(No. 黔科合J字[2012]2039號)

△通訊作者 Tel： 0851- 6752814； E-mail： jianjiangzhou@sina.cn