晚期糖基化終末產物對糖尿病結膜松弛癥的影響

江 兵，徐智勇 ，王安素， 劉 蘇

(1 遵義醫學院附屬醫院 眼科，貴州 遵義 563099 ；2.重慶醫科大學附屬第二醫院 眼科，重慶 400010)

晚期糖基化終末產物對糖尿病結膜松弛癥的影響

江 兵1，徐智勇2，王安素1， 劉 蘇2

(1 遵義醫學院附屬醫院 眼科，貴州 遵義 563099 ；2.重慶醫科大學附屬第二醫院 眼科，重慶 400010)

目的測定晚期糖基化終末產物(AGEs)在糖尿病結膜松弛患者結膜組織及血清中的含量，探討其在糖尿病結膜松弛癥發生過程中的作用機制。方法共收集結膜標本36份(糖尿病結膜松弛癥6例9眼、單純結膜松弛癥5例9眼、糖尿病不伴結膜松弛癥者9例9眼和正常人9例9眼)，血清標本29份(每人靜脈采血),采用競爭性酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)定量測定其AGEs含量。結果在糖尿病結膜松弛組、糖尿病組兩組血清AGEs含量(ng/ml)分別為17.5525± 4.1593和15.7092±3.1896，明顯高于結膜松弛組和正常結膜組的12.0809± 3.2551和9.0161± 2.4255，差異有統計學意義(P<0.05)；在糖尿病結膜松弛組與糖尿病組、結膜松弛組與正常結膜組病組，血清AGEs含量差異無統計學意義(P= 0.089)。結膜組織中AGEs含量在糖尿病結膜松弛組(0.4240 ± 0.0903)、糖尿病組(0.3436 ± 0.0780)、結膜松弛組(0.2682 ± 0.0410)、正常結膜組(0.1895 ± 0.0176)依次降低，各個組間差異均有統計學意義(P<0.05)。結論血清及結膜中AGEs水平升高與糖尿病結膜松弛癥密切相關，高糖環境和AGEs蓄積可能在糖尿病結膜松弛的發生和發展中起到重要作用。

結膜松弛癥；糖尿??；晚期糖基化終末產物

結膜松弛癥是由于球結膜過度松弛,造成松弛的球結膜堆積在眼球與下瞼緣、內、外眥部之間形成皺褶,引起眼表異常的一組疾病[1]。常發生在老年人[2]，有人發現用藥物治療降眼壓的青光眼患者結膜松弛癥發病率較高[3]，也可見于二尖瓣脫垂綜合癥患者[4]。在臨床眼表疾病的診治過程中，發現很多糖尿病患者出現干澀、異物感等癥狀，部分合并球結膜松弛。迄今為止關于結膜松弛癥的病因及發病機制尚無一種公認的理論，有研究認為其發病機制可能與氧化應激、細胞凋亡及炎性介質介導的炎性反應等有關[5-6]。研究表明AGEs濃度的升高與糖尿病及其并發癥密切相關[7]，本研究通過對糖尿病結膜松弛患者血清及結膜中晚期糖基化終末產物的含量進行研究，探討其在糖尿病結膜松弛癥中可能的致病機理。

1 資料與方法

1.1 試劑 人糖基化終末產物(AGE)ELISA試劑盒(Uscn 美國)。

1.2 標本收集與分組 收集2007年1月至2007年12月、重慶醫科大學附屬第二醫院眼科門診和住院的患者共29例(36眼)，按照1999 WTO 糖尿病診斷標準和張興儒眼結膜松弛的臨床分級標準[8]分成如下四組。糖尿病結膜松弛組：結膜松弛程度Ⅲ級-Ⅳ級同時合并2型糖尿病的患者6例(9只眼)，其中男2例，女4例，平均年齡64.34±7.54歲，結膜松弛癥病程2～4年,糖尿病病程3～10年。結膜松弛組：結膜松弛程度Ⅲ級-Ⅳ級，不伴有其他疾病的患者5例(9只眼)，男性2例，女性3例，平均年齡71.20±8.03歲，結膜松弛病程8個月～6年。糖尿病組：年齡、病程與糖尿病結膜松弛組相匹配的2型糖尿病合并白內障需要行手術治療患者9例(9只眼)。正常結膜組：年齡與前兩組相匹配的年齡相關性白內障患者9例(9只眼)，均無其它眼疾患及全身疾病。

空腹靜脈血標本1000轉/ min離心5 min，取上清液500 μL放入-80 ℃低溫冰箱待檢。

糖尿病結膜松弛組和結膜松弛組患者，用平鑷將松弛的球結膜自角膜緣向內眥及下方穹隆輕壓撫平，在距離角膜緣6～7 mm處提鉗夾捏提起球結膜組織，估計欲切除的多余結膜組織量。新月形剪切除下方松弛多余結膜組織作為測量組織中AGEs的實驗標本，8-0可吸收縫線間斷縫合結膜切口并固定于結膜切口下淺層鞏膜。糖尿病組和正常結膜組的患者，行囊外白內障摘除手術過程中沿手術切口部位取對應部位球結膜(取材前均征得患者書面同意)。球結膜組織取下后立即電子天平稱重，錫箔紙包裹放入密閉玻璃瓶中置于-80 ℃冰箱。待球結膜標本搜集齊后，加入低溫PBS倍比稀釋，低溫超聲組織破碎，冷凍離心機(Z 233MK-2 Sigma)8250轉/ min、4 ℃ 冷凍離心15 min后取上清液200 μL放入-80 ℃冰箱待檢。

1.3 實驗方法 采用競爭性酶聯免疫吸附試驗法(ELISA)測定AGEs，結果以ELX800型自動酶標檢測儀測定450 nm處吸光度值，計算AGEs在血清和組織中的水平。嚴格按說明書步驟進行操作。

2 結果

2.1 血清中糖基化終末產物含量 AGEs在糖尿病結膜松弛組、糖尿病組兩組血清中含量明顯高于結膜松弛組、正常結膜組血清AGEs含量，有統計學差異(P<0.05)。糖尿病結膜松弛組與糖尿病組之間，結膜松弛組與正常結膜組之間血清AGEs含量卻沒有統計學差異(P>0.05)。

組別例數AGEs糖尿病結膜松弛組617.5525±4.1593結膜松弛組512.0809±3.2551b糖尿病組915.7092±3.1896正常結膜組99.0161±2.4255b

注：b：與糖尿病結膜松弛組比較，P<0.05。

2.2 結膜組織中糖基化終末產物含量 糖尿病結膜松弛組、糖尿病組、結膜松弛組、正常結膜組4個組球結膜組織中AGEs含量依次降低，各個組間差異都有統計學意義。

組別AGEs糖尿病結膜松弛組0.4240±0.0903糖尿病組0.3436±0.0780b結膜松弛組0.2682±0.0410c正常結膜組0.1895±0.0176d

注：b：與糖尿病結膜松弛組比較，P<0.05；c：與糖尿病結膜松弛組比較，P<0.05；d：與糖尿病結膜松弛組比較，P<0.05。

3 討論

晚期糖基化終末產物(AGEs)是在沒有酶參與的條件下，蛋白質、脂類、核酸等生物大分子物質自發地與葡萄糖及其它還原糖反應產生的共價加成物[9]。非酶促糖基化反應在正常機體即緩慢進行，其形成的AGEs不可逆，AGEs水平隨年齡增長而緩慢增加。Pamplona等[10]研究證實，持久的高血糖會導致人體內許多核酸蛋白、結構蛋白和功能蛋白發生非酶促糖基化，形成不可逆的晚期糖基化終產物。在糖尿病持續高血糖情況下，這一反應的速度顯著加快，AGEs形成量明顯增多。本研究發現血清AGEs含量在糖尿病結膜松弛組、糖尿病組兩組中顯著高于結膜松弛組、正常結膜組，與Pamplona等研究相符。

現代組織學研究證實結膜固有層有I型膠原纖維和Ⅲ型膠原蛋白構成的網狀纖維和彈力纖維等細胞間質成分。膠原是第一個被發現通過AGE修飾形成分子內共價交聯的基質蛋白。有研究發現，在高糖環境下，葡萄糖分子迅速與膠原分子中賴氨酸和羥基賴氨酸的ε氨基發生非酶糖基化反應生成AGEs，并且膠原發生糖基化后其生物和物理特性均發生了變化，不易被酶和酸所降解。在非酶糖基化反應的過程中，體內的還原性谷胱甘肽、VitE、Vitc的水平顯著降低，還引發膠原的合成障礙。本實驗發現在糖尿病患者結膜組織中AGEs異常升高，表明其結膜中膠原質和量可能發生了改變。Daniel Meller認為膠原纖維的溶解可能是導致結膜松弛癥的病理過程，彈力纖維的變性可能是造成結膜松弛癥形成的病理生理學說[11]。糖尿病患者結膜固有層中的膠原在高血糖環境下發生非酶糖基化反應導致結膜組織中AGEs增多、膠原變性及膠原合成減少，網狀纖維和彈力纖維也會發生變性和減少，促使糖尿病患者結膜松弛的發生。

AGEs具有廣泛的致病作用。AGEs形成后引起蛋白質分子間廣泛交聯可從多個方面影響機體，如引起血管通透性增大、血管基膜增厚和細胞外基質積聚等[12-13]。糖尿病患者結膜血管通透性增加后血液中的AGEs更多的進入結膜組織中。近期研究表明，人血管內皮細胞膜上表達多種特異性的AGEs受體(RAGE)，AGEs與RAGE結合后可引發細胞內氧化應激、亞鐵血紅素加氧酶1的表達和轉錄因子(NF一κB)的激活，同時還可進一步增強AGEs受體表達，引起持續的細胞損傷和功能紊亂14]。此外，AGEs在組織中的水平還與RAGE在組織分布的特異性有關。有研究[15]顯示，糖尿病患者體內成纖維細胞膜上RAGE持續高表達。在糖尿病患者結膜固有層中成纖維細胞膜上RAGE可能持續高表達，結膜組織中AGEs水平也增高。本實驗中糖尿病結膜松弛患者結膜組織中AGEs含量明顯高于其他三組，可能與血糖水平高、結膜組織固有層膠原相對豐富、血管通透性增加以及結膜組織中成纖維細胞膜上RAGE持續高表達有關。有人將大鼠尾鍵膠原與葡萄糖或核糖混合孵育7周，發現膠原纖維間的距離加大，認為與AGEs與RAGE結合后可引發氧化應激有關。該現象與糖尿病結膜松弛中膠原變化極為相似。我們推測結膜組織AGEs與RAGE結合后，導致氧化應激，細胞損傷，進而引起糖尿病結膜松弛的發生。本實驗中糖尿病無結膜松弛患者結膜組織中AGE較單純結膜松弛患者高，可能糖尿病患者體內RAGE高表達有關。對于單純結膜松弛癥AGE低于無結膜松弛癥的糖尿病，提示結膜松弛除與AGEs有關，可能還有其他致病因素，如Li等[16]報道了結膜松弛癥與基質金屬蛋白酶的過度表達和增生活躍有關。

葡萄糖濃度升高，使血清、球結膜組織中的AGEs異常增加，AGEs在結膜組織中蓄積，AGEs對結膜血管內皮細胞的損害、固有層膠原糖基化、氧化應激損傷等，導致結膜組織細胞賴以生存的空間結構發生相應的改變，同時引起結膜組織細胞生存的微環境理化性質的紊亂，促使糖尿病結膜松弛的發生、發展。

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Effectofadvancedglycationendprodutsindiabeticconjunctivochalasis

Jiangbing,Xuzhiyong,Wangansu,Liusu

(1.Department of Ophthalmology，The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou Zunyi 563099,China;2.Department of Ophthalmology，The Affiliated Second Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China)

ObjectiveThis study was to investigate the level and role of AGEs in diabetic conjunctivochalasis.MethodsThe levels of AGEs were assessed by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 36 conjunctive tissue samples and 29 serum samples which were collected from the patients with diabetic conjunctivochalasis (9 eyes of 6 cases), only conjunctivochalasis (9 eyes of 5 cases), diabetes without conjunctivochalasis (9 eyes of 9 cases) and normal subjects

extracapsular extraction (9 eyes of 9 cases).ResultsMean levels of serum AGEs (ng/mL) in diabetic conjunctivochalasis and diabetes were 17.5525±4.1593 and 15.7092±3.1896, showing a significantly higher level than those of only conjunctivochalasis group and normal conjunctiva group (12.0809±3.2551, 9.0161±2.4255) (P<0.05). There was no statistically significant difference in the level of serum AGEs in diabetic conjunctivochalasis group and diabetes group(17.5525±4.1593 vs 15.7092±3.1896), conjunctivochalasis group and normal conjunctival group (12.0809±3.2551 vs 9.0161±2.4255).The levels of AGEs (ng/mg) in conjunctive tissue decreased gradually in diabetic onjunctivochalasis group(0.4240±0.0903)， in diabetes group(0.3436±0.0780)，conjunctivochalasis group(0.2682±0.0410) and normal conjunctival group(0.1895±0.0176). There was statistically significant difference in the level of AGEs in conjunctive tissue between any two group (P<0.05).ConclusionThe higher levels of AGEs in serum and conjunctival tissue were closely correlated with diabetic conjunctivochalasis. High glucose and AGEs accumulation may play a critical role during the occurrence and development of diabetic conjunctivochalasis。

conjunctivochalasis;diabetes;aadvanced glycosylation end products

重慶市教委科學技術研究基金項目(NO：KJ060319)。

R544.1

A

1000-2715(2013)05-0449-04

[收稿2013-06-15;修回2013-08-17]

(編輯：譚秀榮)