結核分枝桿菌臨床分離株對四種注射用抗結核藥物耐藥及交叉耐藥分析

常珊 付育紅 李琦 卜建玲 黃海榮 馬玙 陳效友

WHO 2010年報告［1］，我國在耐多藥結核病患者數量最多的5個國家中居首位。2008年全國耐藥結核病基線調查報告指出［2］，我國結核病總耐藥率37．39%，耐多藥率8．32%，廣泛耐藥率0．68%，2010年全國第五次結核病流行病學調查［3］結果報告耐多藥率為6．8%，由此可估算我國近5年每年新發耐多藥結核病患者約9．8萬～12萬例，遠高出全球平均水平，防控形勢十分嚴峻。鏈霉素（S）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）和卷曲霉素（Cm）均屬于注射用抗結核藥物，是耐藥結核病治療方案中的重要組成部分。由于對這四種藥物之間的交叉耐藥關系一直存在爭議，為了更好地使用這一類藥物，組成更合理的耐藥結核病的治療方案，筆者對本院2004—2010年所有的臨床分離株的4種注射劑的耐藥情況進行分析，并報告如下。

材料和方法

一、菌株來源

4247份結核分枝桿菌臨床分離株來自2004年1月至2010年12月北京胸科醫院就診4247例患者的痰液標本，所有陽性菌株經對硝苯甲酸（PNB）及噻吩二羧酸肼（TCH）進行菌種鑒定為結核分枝桿菌。其中：2004年256份，2005年353份，2006年335份，2007年631份，2008年711份，2009年988份，2010年973份。來源患者中男2629例，女1618例；年齡3～92歲，平均年齡（49．32±8．71）歲。

二、培養方法及藥物敏感試驗

所有菌株采用改良羅氏培養基進行結核分枝桿菌培養，兩濃度的絕對濃度法進行藥物敏感試驗，S、Km、Am和Cm的藥物敏感試驗方法參照文獻［4］，4種藥物耐藥菌株的入選均以每種藥物10μg／ml的含藥培養基上生長菌落占據1／4斜面及以上（＋～＋＋＋＋）作為標準。4種藥物均購自美國Sigma公司。質控菌株為 H37Rv（ATCC27294）標準株，為本院參比實驗室保存。

三、統計學方法

應用SPSS 13．0統計軟件進行數據統計處理，4種藥物之間總耐藥率的差異采用配對χ2檢驗及χ2分割法，以P＜0．007 14為差異具有統計學意義。4種藥物之間交叉耐藥率的差異采用兩個樣本率比較的χ2檢驗，以P＜0．05為差異具有統計學意義。

結 果

1．總體耐藥情況：總計4247份標本中，S的耐藥 率 為 45．11% （1916／4247），Km 的 耐 藥 率 為17．93% （718／4005），Am 的 耐 藥 率 為 19．02%（792／4164），Cm 的耐藥率為 9．44%（401／4247）。經配對χ2檢驗，Cm與S、Am、Km之間耐藥率差異有統 計學意義，χ2值 分 別為 1349．34、281．54、193．16，P值均＜0．007 14。經配對χ2檢驗，S與Am、Km之間耐藥率差異有統計學意義，χ2值分別為821．10、869．28，P 值均＜0．007 14。經配對χ2檢驗，Am與Km之間耐藥率差異有統計學意義，χ2值為13．98，P 值＜0．007 14。因此，4種藥物的耐藥率以S的耐藥率最高，Cm的耐藥率最低，Am排在S之后，Km排在Am之后，即S＞Am＞Km＞Cm。4種藥物耐藥率在不同年份的具體數值及總體耐藥率的結果見表1。從近7年的耐藥率變化來看，S的耐藥率一直高于其他3種藥物，且較為穩定，另外3種藥物的耐藥率在2008年及2009年出現了小幅度的升高，到2010年又有所下降。

表1 4247份標本4種藥物的總耐藥率

2．交叉耐藥情況：（1）S在Km、Am和Cm 3種耐藥株中的 耐 藥 率 分 別 為 82．59% （593／718）、77．78%（616／792）和76．81%（308／401）。經統計學處理，χ2值分別為502．959、453．911、626．654，P值均＜0．05。（2）Km在S、Am和Cm 3種耐藥株中的耐藥率分別為33．13%（593／1790）、83．31%（634／761）和67．89%（260／383）。經統計學處理，χ2值 分 別 為 502．959、12．079、100．536，P 值 均＜0．05。（3）Am 在S、Km 和Cm 3種耐藥株的耐藥率分別為32．78%（616／1879）、89．55%（634／708）和77．95%（304／390）。經統計學處理，χ2值分別為453．911、12．079、163．761，P 值均＜0．05。（4）Cm在S、Km和Am 3種耐藥株中的耐藥率分別為16．08%（308／1916）、36．21%（260／718）和38．38%（304／792）。經統計學處理，χ2值分別為626．654、100．536、163．761，P 值均＜0．05。

討 論

本資料分析結果顯示，4種藥物總的耐藥率由高到 低 依 次 為 S （45．11%）、Am（19．02%）、Km（17．93%）、Cm （9．44%）。4種藥物耐藥率高低順序結果與2008年王生偉等［5］報道一致。施旭東等［6］2004年報道1046份改良羅氏培養藥物敏感性試驗結果顯示，S耐藥率30．3%，Km 耐藥率10．5%，Am耐藥率8．2%，Cm 耐藥率3．3%，本研究中4種藥物的耐藥率與之比較都偏高，可能與樣本量的大小、標本來源于不同地區及4種藥物的近6年來使用頻率不同有關。本研究結果提示Am的耐藥率略高于Km耐藥率，與施旭東等［6］研究結果不同，可能與近幾年來Am的使用率高于Km有關。另從近7年耐藥率變化來看，4種藥物的耐藥率都呈現出逐漸上升的趨勢，但2010年的耐藥率又有所回落。2010年全國第五次流調結果與2008年耐藥結核病基線調查報告的結果相比較，耐多藥率是有所下降的，本研究結果與此變化趨勢是一致的，2010年4種藥物耐藥率的下降可能與耐多藥結核病比率下降有關。

這4種藥物均為注射用抗結核藥物。除Cm為環多肽類藥物外，其他3種均屬于氨基糖甙類藥物。兩類藥物均以抑制細菌蛋白質的合成為主要機制，但作用靶點不完全相同［7］。自氨基糖甙類藥物誕生起，即陸續出現對這類藥物存在交叉耐藥現象的報道。交叉耐藥是指細菌對一種抗菌藥產生耐藥后，對其他作用機制相似的抗菌藥也產生耐藥性。通常認為S與Km和Am為單向交叉耐藥，Km和Am之間為完全交叉耐藥，這3種藥物與Cm之間為單向交叉耐藥［7］。但文獻報道結果并非完全一致。1987年，巖井和郎等［8］認為S與Km為單向交叉耐藥，但Km和Cm之間為完全交叉耐藥。倪正義等［9］報道，對Am低度耐藥的患者有92．1%對Km仍然有效，而對Km低度耐藥者僅36．4%對Am敏感。上海曹廣云等［10］報道448例藥敏結果顯示，S在Am耐藥株和Cm耐藥株中的耐藥率分別為96．7%和91．2%，而Am在S耐藥株中的耐藥率為31．2%，Cm在S耐藥株中的耐藥率為27．5%，因此可以認為S與Am和Cm之間為單向交叉耐藥。而Am在Cm耐藥株中耐藥率為82．5%，Cm在Am耐藥株中的耐藥率為77%，因此認為兩種藥物為雙向交叉耐藥。國外關于4種藥物的交叉耐藥情況結果也不完全一致，特別是Am和Km之間的交叉耐藥情況，差別較大，但通常樣本量較小。如Kruuner等［11］和 Maus等［12］的兩個研究報道各約80例樣本中，耐Km株中仍有50%左右對Am敏感。2009年Jugheli等［13］報道78例Km耐藥株中11．5%對Am敏感，20．5%對Cm敏感，而Am耐藥株中未見到Km敏感株。本研究結果顯示，S在另外3種藥物耐藥株中的耐藥率為76．81%～82．59%，而另外3種藥物在S耐藥株中的耐藥率為16．08%～33．13%，據此認為S與另外3種藥物雖然存在交叉耐藥，但耐藥率差別較大，交叉耐藥水平較低，可認為S與其他3種藥物之間均為單向交叉耐藥，與曹廣云等［10］研究結果一致。Cm在另外3種藥物耐藥株中的耐藥率為16．08%～38．38%，另外3種藥物在Cm耐藥株中的耐藥率為67．89%～77．95%，因此Cm與另外3種藥物之間也應為單向交叉耐藥。2008年，耐藥結核病規劃管理指南緊急修訂版中也認為Cm和其他氨基甙類藥物之間有低水平交叉耐藥［14］。最后，本研究結果顯示，Km耐藥株中Am的耐藥率為89．55%，Am耐藥株中Km的耐藥率為83．31%，兩者差異雖有統計學意義，但χ2值遠遠小于其他幾組藥物，且從臨床實際出發，此交叉耐藥率的差別過小，應認為兩者為完全交叉耐藥。提示，在臨床用藥中，應優先推薦遵從S到Am到Cm的單向用藥順序，另當S耐藥時可選擇使用Am或者是Km，當Am和Km耐藥時可以選擇使用Cm。

目前研究認為，4種藥物交叉耐藥產生的原因是由于存在共同的基因突變位置。如S的耐藥主要由于rspl和（或）rrs基因突變所致［15］。其他3種藥物耐藥均有rrs基因突變參與［13］。而Cm的耐藥產生與rrs、thyA及gidB3個基因突變均有關聯［16］。其中Km和Am的耐藥產生均與rrs1401位點的突變密切相關，特別是高濃度耐藥時，其基因型和表型的關聯更為密切［17，18］。多個文獻報道均發現不同形式、不同程度的交叉耐藥經常表現為不同形式的基因突變［12，16，18］。但本研究并未對4種藥物耐藥株的相關耐藥基因突變情況進行檢測和分析，因此尚不能從基因水平說明4種藥物交叉耐藥的分子機制。

從本研究所總結的7年的臨床資料來看，4種藥物的耐藥率從高到低依次為S、Am、Km、Cm，4種藥物之間均表現出交叉耐藥，但程度不同。S與其他3種藥物之間為單向耐藥，Km和Am兩個藥物之間近似完全交叉耐藥，Cm與其他3種藥物之間為單向耐藥。

［1］WHO．耐藥結核病臨床醫生使用指南．2版．北京：中國疾病預防控制中心結核病防治中心，2010．

［2］中華人民共和國衛生部．全國結核病耐藥性基線調查報告（2007—2008年）．北京：人民衛生出版社，2010．

［3］全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組，全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室．2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告．中國防癆雜志，2012，34（8）：485-508．

［4］中國防癆協會．結核病診斷細菌學檢驗規程．中國防癆雜志，1996，18（1）：28-33．

［5］王生偉，張俠．1996—2006年南京地區結核病耐藥狀況分析．中國防癆雜志，2008，30（5）：408-410．

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