HLAMatchmaker軟件分析Eplets的配型在臨床腎移植配型中的應用*

張 行，潘曉東，徐慧英，吳存造，蔡 勇，夏 鵬，鄭少玲，楊亦榮，陳必成，△

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院外科實驗室，2.移植中心，浙江溫州325000）

HLA（human leukocyte antigen）是人類最復雜的基因多態性系統，同種異體移植術前需進行供受者間HLA配型。HLA抗原零錯配能獲得較高的移植成功率和較長的術后生存期，但是回顧性研究中發現某些存在多個HLA抗原錯配的移植亦能取得較好的效果［1］。因各 HLA間存在交叉反應組抗原（CREGs），具有相同或相似的抗原決定簇結構或氨基酸殘基，組內有較好的匹配，但也可產生此組抗供者抗體的交叉反應。在此基礎上的CREGs配型策略，認為可接受性錯配抗原（permissible mismatched antigen）為零錯配，擴大了可接受的供體選擇。但CREGs的缺點是根據經驗結果總結，不能進行精確的評估可接受錯配和不可接受的錯配。

HLAMatchmaker（Duquesnoy教授基于微軟公司的 Excel軟件開發，http：／／www.hlamatchmaker.net／）軟件可以通過計算機比對HLA的接受程度，它基于分子免疫學的以下兩個原理：（1）每一個HLA分子是由一系列能各自產生特異性抗體的Eplets（決定抗原決定簇特異性的關鍵氨基酸組成，指位于HLA分子表面3.0～3.5埃（1埃 ＝1×10-8cm）大小的空間多態性位點）；（2）移植受者不會產生針對自身HLA Eplets的抗體。為此設計的HLAMatchmaker可計算供受者間HLA氨基酸序列Eplets的差異，能夠定量地分析出Eplets錯配數，給出不兼容的錯配位點，找到可接受的錯配（acceptable mismatch）從而尋找合適的供者，提高移植術后受者的生存率［2］。運用此軟件分析可避開基因錯配位點，讓群體反應性抗體高敏感性受者亦能接受移植［3］。本研究中我們回顧性對239例移植受者運用3種現有配型方法即HLA六抗原無錯配配型、交叉反應組配型和基于HLAMatchmaker軟件的Eplets配型，分析 Eplets配型優越性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年1月份至2012年12月份期間在溫州醫科大學第一醫院移植中心進行239例腎移植的受者，其中男性 169例（70.7%），女性 70例（29.3%），最大年齡 70，最小年齡17歲，平均年齡（45.23±11.70）歲，O型103例，A型 66例，B型 48例，AB型22例，供者共139例。移植供受者的ABO血型匹配。PRA（panel reactive antibody）≥10%陽性病人17例（7.11%）。

1.2 HLA檢測方法

采用美國 One Lambda公司的 Micro SSP HLA Class and ABDR DNA Typing Tray通過低分辨率的順序特異引物聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction with sequence-specific primers，PCR-SSP）方法檢測出HLA的配型，用 HLAMatchmaker中的（4-digit Convert）將血清學的HLA轉化成基因型的HLA，另外有部分標本采用GenDX公司Sanger法基因測序試劑盒檢測HLA的基因型。

1.3 配型方法

1.3.1 HLA配型 采用美國器官分配聯合網（United Network for Organ Sharing，UNOS）在 1990年制定的HLA六抗原無錯配標準（Zero HLA-A，B，DR Antigen Mismatch，0 Ag Mismatch）：供受者HLA存在一個抗原錯配得一分，抗原錯配數累積，分值在0～6之間，分數越低匹配度越高。

1.3.2 CREGs配型 Thompson提出的 HLA氨基酸殘基配型，又稱交叉反應組配型（HLA-cross reactive groups matching，CREGs）［4］。在此基礎上我們進行了得分累積的改進：供受者HLA六抗原位點完全匹配為0，不匹配但如屬于同一交叉反應組則得分為0.5，此外的不匹配為1分，分值在0～6之間，分數越低匹配度越高。

1.3.3 HLAmatchmaker軟件配型 供受者 HLA-Ⅰ基因型使用（ABC Matching for 500 donor-recipient pairs）和 HLA-Ⅱ基因型（DRDQMatching for 500 donorrecipient pairs），HLAmatchmaker軟件對 HLA-Ⅰ 和HLA-Ⅱ分別進行配對，尋找出錯配數及錯配Eplets，在Eplets表達式中，如66 RNM代表一個天冬氨酸，在氨基酸序列第66位用字母N表示，而相鄰的第65位精氨酸和第67位蛋氨酸分別用字母R和M表示。如果前后的氨基酸同中間的氨基酸相同，則表達式中不再重復顯示，如9F代表氨基酸序列第9位的苯丙氨酸，62QE代表氨基酸序列第62位的甘氨酸和第63位為谷氨酸。然后在通過EXCEL合計錯配數，分數越低匹配度越高［5］。

1.4 統計學分析

三種方法分組人數之間比較采用多分類列表概率分布檢驗計算，三種方法所得錯配數通過兩兩比較采用秩轉換結合隨機取組設計的方差分析檢驗計算。實驗數據所有統計均由SPSS 16.0軟件完成。

2 結果

2.1 HLAMatchmaker結果顯示形式

在HLAMatchmaker軟件中輸入相對應的供受者的基因型，HLAMatchmaker軟件會自動分析供受者之間Eplets錯配的數量和位點。如：受者的HLA-Ⅰ的基因型為 A*0301、A*3001、B*1302、B*2705，而供者 HLA-Ⅰ的基因型 A*0201、A*3001、B*1302，根據軟件分析結果顯示，共計存在11個Eplets錯配，而這些錯配分別用不同位點的氨基酸表示62GE65RKA70AHS116Y127K142MT144TKH151HV207 S184A193AV。另外運用相同的方法獲得該供受者HLA-ⅡEplets的錯配（表 1）。

2.2 三種方法錯配數得分

239例腎移植的三種配型方法所獲得的錯配情況，其中6例在表2中列出，如Case 3中傳統的HLA抗原配型組顯示HLA-Ⅰ、Ⅱ分別為3分和2分，合計為5分；在CREGs配型組中，HLA-Ⅰ、Ⅱ分別存在2分和 1.5分，合計 3.5分；HLAMatchmaker軟件配型的結果顯示，HLA-Ⅰ、Ⅱ均為18分，合計36分。三種方法計算的239例供受者配型計錯配數得分，秩轉換并經SPSS軟件統計計算，顯示 HLAMatchmaker軟件配型的方法與傳統HLA配型、CREG交叉反應抗原組配型有顯著性的差異（表2，P＜0.01）。

2.3 三種配型方法的分布

HLA對239供受者HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分數，根據HLA抗原錯配結果將受者分為7組，分別：0個 Mismatch（MM）組 1例；1個 MM組 2例；2個MM組16例；3個MM組31例；4個MM組81例；5個MM組72例；6個MM組36例。

CREGs對239供受者HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分數，0個MM組1例；0＜n≤1個MM組4例；1＜n≤2個MM組為27例；2＜n≤3個MM組為73例；3＜n≤4個MM組為89；4＜n≤5個MM組為39例；5＜n≤6個MM組為6例（表3）。

HLAMatchmaker對239供受者 HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原配型所得分數，根據 Valentini［6］建立了一套相對完善的標準，0個 Eplets Mismatch（EMM）組1例；0＜n≤10個EMM組10例；10＜n≤20個 EMM組43例；20＜n≤30個 EMM組73例；30＜n≤40個EMM組66例；50＜n個EMM組8例（表3）。

Tab.1 Examples of donor-recipients HLA-Ⅰ mismatch with HLAMatchmaker at the Eplets level

Tab.2 Examples of donor-recipients HLA the number of mismatch with three methods

Tab.3 Results of HLA matching，CREGmatching and HLAMatchmaker typing matching in grouping

根據表3的結果將 HLA、CREGs和 HLAMatchmaker三種方法所得分數結果按照3個組別進行分組，分別為低錯配組、中錯配組和高錯配組（圖1）。在低錯配組中，HLA、CREG和 HLAMatchmaker分別為 19（7.9%）、32（13.4%）、54（22.6%）；中錯配組中分別為 112（46.9%）、162（67.7%）、139（58.1%）；高錯配組中，分別為 108（45.2%）、45（18.8%）、46（19.2%）。從結果上分析，三種方法存在顯著差異（χ2＝66.68 P＜0.01），HLAMatchmaker配型方法相比較其他兩種方法在0～2低錯配組別的人數較明顯的增加，而3～4中錯配組別HLAMatchmaker配型方法的人數介于傳統HLA和CREGs兩種配型方式之間，5～6高錯配的高錯配組別 HLAMatchmaker人數與CREGs方法人數相近，且這兩種方法的人數明顯少于傳統的HLA配型方法。從表4中可以看出，HLAMatchmaker相對于其他兩種方法可以明顯提高供受者的相配率。

Tab.4 Comparison among three methods of HLA matching group in 239 donor-recipients

Fig.1 Number of recipients gruoping by low-high MM

3 討論

器官移植中，不管國際或者國內均普遍采用HLA六抗原無錯配為標準的配型，但由于HLA在基因上的高度多態性及復雜的蛋白空間結構，供受者間存在HLA-Ⅰ、Ⅱ抗原零錯配的概率很低，致使患者需等待較長時間才得以移植手術。但是隨著移植免疫學的發展，提出了CREGs的配型方法，是指特異性血清學反應格局的公共抗原為同一組零錯配，該方法通過HLA抗原分子公共抗原表位在一定程度上提高了HLA無錯配和低錯配的幾率，并且在之前的研究中顯示出了較好的臨床應用價值，CREGs抗原相合的腎移植術后效果要優于CREGs抗原不相合的［7］。但是CREGs同樣存在缺陷，亦無法精確地預測HLA分子的立體化學空間結構和氨基酸序列間的差異，依然將配型停留在抗原水平，而現在的HLA分型則大多開始采用分子生物學的技術，如PCR和測序等，使得HLA分型的準確性和精確度都得到了較大的提高。而根據CREGs的這種配型方式已無法滿足HLA基因型多樣性和對新基因型的配型需求。此外，生物信息學的迅速發展，使蛋白質三維結構模擬的技術更加成熟，但是一直缺乏一種能在空間立體結構層面比較HLA分子的配型方法，為此Duquesnoy教授引入了Eplets這樣全新的概念并開發出HLAmatchmaker軟件以解決此問題。而我們在此軟件的基礎上，首次將該軟件應用于臨床中腎移植手術前的配型和對移植術后的抗體預判。

HLAMatchmaker軟件配型的方法則是基于E-plets位點間的比對，給出不兼容的錯配。本研究將本中心兩年間的239例次腎移植受者，按照傳統HLA配型、CREGs配型和基于HLAMatchmaker軟件配型進行比較，HLAmatchmaker配型方法的低錯配人數明顯少于其他兩種方法，并有顯著性差異（P＜0.01），說明 HLAMatchmaker能明顯提高相配率。同時HLAMatchmaker軟件能在抗原結構相容性上更精確地發現錯配，即HLA抗原型相同，也可能存在個別Eplets的不同；但其優勢是在供受者HLA分型不同時對比Eplets組合找到最少的錯配。由于個體攜帶的Eplets庫差異，即使供、受者HLA 6抗原型完全不相同，亦有找到低錯配的可能；此外，在傳統HLA配型和 CREGs配型認為較好的配率，但是 HLAMatchmaker卻能篩選出較多存在的錯配Eplets，反之亦然。從結果中顯示三種方法的錯配存在著明顯的統計學差異（P＜0.01）。采用 HLAMatchmaker軟件的配型方法不但擴大了供體選擇的范圍同時也更容易找到優質供者。

在以往的研究中運用HLAMatchmaker軟件進行Eplets配型可顯著降低腎移植術后的致敏性。Duquesnoy教授回顧性研究了1987～1999年間美國器官分配和聯合網絡（UNOS）和歐洲器官庫（Eurotransplant）數據中的HLA-DR抗原零錯配的腎移植情況下，結果發現腎移植受者HLA-A、B在0～4個E-plet錯配的情況下5年移植物生存率為（76.30±3.11）%，而傳統 HLA-A、B抗原零錯配的生存率為76.8%，兩者未顯示出差異，說明了即使存在少數的EMM的情況下同HLA-A、B抗原零錯配長期生存率基本一致，而且此結果在不同膚色種族及是否為高致敏受者并不受影響。同時HLAMatchmaker的配型方式能夠顯著降低腎移植術后的致敏性，改善移植物的存活率［2，8］。此外亦能根據每個受者那些EMM（Eplets mismatch）位點再次通過 HLAMatchmaker系列的軟件進行直接分析得出受者移植術后預判具體HLA特異性抗體及其產生的幾率［9，10］。以上均顯示了HLAMatchmaker軟件在移植配型有非常突出的優勢和廣泛應用的潛力。

使用HLAMatchmakers軟件來進行配型，不但可以處理供者和大量潛在受者之間的配型，提高工作效率。同時該方法擴大了移植受者的可接受群體，有機會考慮影響移植結果的其他因素。由于完全基于計算機的計算和統計，避免了傳統HLA配型和使用CREGs配型容易造成的人為誤配。HLA配型是決定移植腎和受者存活的重要因素，應用 HLAMatchmaker軟件配型的方法，能夠有效提高受者和腎的存活率，同時降低腎移植后急性排除的發生率。良好的配型可減少免疫抑制劑的用藥量，有效避免藥物濃度過高引起的毒性反應，也節省了費用。在T細胞免疫可被控制的移植時代，HLAMatchmaker軟件配型符合精確、高效的要求，并對避免和分析體液免疫提供了全新的工具。

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［5］ 張 行，潘曉東，陳文偉，等.HLAMatchmaker軟件在HLA配型中的應用原理及前景［J］.中華移植雜志（電子版），2013，7（1）：42-47.

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［10］Duquesnoy RJ.Antibody-reactive epitope determination with HLAMatchmaker and its clinical applications［J］.Tissue Antigens，2011，77（6）：525-534.