細胞培養技術的研究進展

宋 鴻，韓云竹，蔡國徽

(遵義醫學院 微生物學教研室，貴州 遵義 563099)

細胞是高等生物有機體一切生命活動的基本單位，個體發育過程中無數功能及形態各異的細胞形成了不同的組織和器官，這個復雜的過程不僅受遺傳物質的調控，更離不開三維立體微環境中各種細胞因子、生長因子、細胞間及細胞與細胞外基質(extra- cellular matrix，ECM)間相互粘附等多種信號的調節。體外細胞培養技術就是在體外維持細胞、組織及器官生存及生長的一種技術。根據細胞培養對象，可采用不同的方法和技術。傳統的細胞體外研究多采用單層細胞培養法，培養裝置常為玻璃或塑料的二維平面。事實上，這種培養方法是無法模擬具有空間結構的ECM與細胞之間的相互作用，許多細胞從組織中分離并進行二維平面培養后，會逐漸平面化、異常分化并失去分化表型[1]。數十年來人們逐漸認識到，細胞外微環境中各種細胞因子、神經遞質、細胞之間及細胞與ECM相互粘附等多種信號積極參與了調節細胞的生長、分化、增殖及凋亡等生命活動[2-4]。因此細胞培養技術經過不斷的改進，經歷了由二維到三維，由靜止三維培養到動力三維培養的過程?，F將細胞培養技術的發展、細胞培養支架材料以及細胞培養的影響因素進行綜述。

1 二維細胞培養

1907年，Harrison用懸滴培養法培養蛙胚神經獲得成功，創立了最早的動物細胞二維培養法，經過不斷改進，發展到現代的培養瓶、培養皿培養。由于二維培養方法具有培養簡單、易操作、費用低、可大批量應用等優點，因此已經成為了體外細胞培養的主要方法。然而，這種培養方式存在著許多缺點：首先，在體內組織細胞所處的局部微環境是三維立體的，它們的運動經常受到局部化學信號或分子梯度的影響，分子梯度對于細胞的分化、組織器官的形成、信號傳導、神經信號傳遞及許多生物代謝過程起著重要的作用，但是在常規的體外二維培養方法中幾乎是不可能建立這種的三維分子梯度的，因此二維培養不能夠為組織細胞提供正常生長發育的環境條件，而生長環境對細胞基因表達及行為有著重要的影響。有研究發現，從小鼠體內得到的具有多藥耐藥性的腫瘤細胞[5]，在體外進行二維培養后，其多藥耐藥性會消失，而在三維培養條件下，會恢復其多藥耐藥性[6]。由此可見以單層細胞為模型，研究腫瘤對放化療敏感性，所得到的結果與體內試驗往往存在很大的差距[5,7]；其次，直接從機體中分離得到的原代細胞，在二維培養條件下它們的代謝及基因表達譜會發生不斷地變化。雖然在組織和器官中ECM蛋白和細胞受體之間的相互作用是普遍存在的現象，但細胞結構決定了細胞活性。細胞膜結構、ECM及基底膜經蛋白與蛋白之間的相互作用影響著整個細胞的代謝過程。在二維培養中常需要調節細胞的密度，以便于細胞適應外在環境，這不僅僅改變了氧氣、營養物質和ECM間的相互作用，也改變了細胞內代謝產物的清除；此外，細胞在二維環境生長過程中可使ECM蛋白和細胞形態發生改變，這可能是由于細胞表面的受體首先聚集在直接暴露于培養液的細胞局部所導致，然而實際上在機體內粘附于細胞表面的受體是很少有機會聚集的，因此在二維培養條件下這種聚集現象可能導致細胞表面的受體位置偏離，從而影響了細胞間的相互作用；除此之外，在二維培養中，細胞附在底物平面上生長，因缺少立體支架，只能向二維發展，細胞失去原有的立體形態。因此，二維培養所反映的生物學性狀，與體內組織細胞相差甚遠。通常的結果是細胞發生去分化現象，培養的細胞不僅失去了正常的形態，而且失去了其生化與功能特性，如軟骨細胞在單層培養過程中，呈現出類似成纖維細胞的去分化形態，并且由正常條件下的分泌Ⅱ型膠原轉變到分泌Ⅰ型膠原[8]，這一形態與功能變化與培養條件有關?？梢婓w外組織細胞的培養受到眾多因素的影響，二維培養已不能滿足組織細胞正常生長發育所需的局部微環境。

2 三維細胞培養及其支架材料

隨著對細胞所處微環境的了解，細胞培養技術經歷了從二維到三維的發展過程。三維培養就是利用各種方法及材料，使細胞呈空間立體方式生長。這種生長方式更接近于體內生長模式，形成類似體內的組織結構，發揮其功能，因此三維培養體系為細胞提供了類似體內生長環境的支架或基質，同時細胞通過緊密連接和縫隙連接等方式建立了細胞間及細胞與ECM間的聯系，形成了一定的三維結構。

East等[9]使用三維培養系統記錄了不同腫瘤通過正常組織每天的移動速率后，推進了細胞三維培養技術的迅速發展?，F研究發現體外細胞三維培養受到眾多因素的影響，如種子細胞、生物支架材料、生長因子、力學環境等[10]，其中生物支架材料的影響尤為重要。在過去的20年中，一些生物聚合材料如PLLA、PLGA、PLLA-PLGA共聚物，及生物材料如藻酸鹽、瓊脂糖、膠原等[11-14]已經被廣泛用于體外細胞三維培養中，這些培養體系最突破性進展強調了生物材料模擬自然發生的三維細胞與細胞之間、細胞與生物材料支架之間的相互作用，可以說細胞三維培養技術促進了組織工程學的發展，為其開創了一個新領域[15]。

合成聚合物或共混聚合物材料的目的就是建立體外細胞三維培養，然而這些聚合物生物材料的微纖維直徑一般為10～50 μm，與大部分細胞的直徑(5～30 μm)相近，這使得吸附在微纖維上的細胞處于二維弧形環境里，實際上細胞仍處于一種二維培養環境中。此外，這些聚合物生物材料所形成支架網孔直徑一般為10～200 mm，這比一般的生物分子大了1000～10 000倍，結果導致生物分子快速擴散，因此對于一個真正而言的三維環境，構成支架的纖維及所形成的網孔直徑一定比培養細胞小的多，這樣細胞被支架纖維所包繞，這就好比模擬體內環境，使細胞處于一種ECM環境中[16]。

此外，一些來源于動物的生物材料如膠原蛋白、粘多糖及Matrigel等用于細胞三維培養中[17-19]，但是對于所有動物來源的材料來說，一個潛在的問題就是它們可能攜帶危險的病原菌[20]，如朊病毒是最令人擔心的病原菌，或經常會帶有一些殘留的生長因子及一些成分不清或數量不確定的混雜物，這將導致產品的質量比較難控制。這些問題不僅給實驗研究帶來了困難，也為組織工程用于人體疾病的治療帶來了巨大的麻煩。因此，理想的三維培養體系必須明確細胞支架合成生物材料的組分，就這而言，分子自組裝肽支架有可能被選擇用作細胞三維培養支架。分子自組裝肽支架因成分純凈、性能穩定、無免疫原性且降解產物無毒、具有較好的生物相容性及可調控的生物降解性[21]，被視為理想的細胞培養支架材料。已有研究表明，自組裝短肽RADA16具有良好的結構與性能，能提供類似ECM結構的微環境，較好的進行神經細胞、軟骨細胞、肝細胞等的體外三維培養[21-22]。

3 細胞培養的影響因素

3.1 細胞粘附與相關結構 腫瘤侵襲過程中，腫瘤細胞必須先與ECM發生接觸，隨后酶解并穿過ECM，而與ECM及其鄰近細胞的粘附決定了腫瘤細胞的形態及其組織結構特性。此外，為了調節生長、分化、增殖及遷移等細胞行為，細胞需要綜合粘附的成分、結構、數量等多種信號[23]。故體外研究細胞的生物學行為需將細胞從原生細胞間及細胞與ECM的相互作用中剝離，再引入設定的二維或三維培養新環境中。

二維與三維細胞體外培養最顯著的區別在于細胞形貌的差異。當細胞在二維平面生長時，很容易在水平表面粘附、遷移，但無法在空間層面擴展。原因之一是細胞生長在二維平面時存在頂底極性，這種極性與某些類型的細胞有關，如上皮細胞，但大多數間充質細胞卻出現異?！斣谌S基質中再培養，則表現為星形且遷移期間只從前到后發生極化[24]，而這種細胞幾何結構及構成的變化可直接影響細胞的功能[25]。有研究表明，細胞的扁平化可有效增加表面體積(即細胞膜與細胞質)比，從而有利于信號物質從細胞表面進入內部[26]。通過在二維平面中設置“微型粘附島”，研究者發現細胞伸展程度的變化會對細胞增殖、凋亡及分化等產生影響[27]。除了伸展的總面積，細胞的幾何形狀也會改變細胞的功能[28]。雖然二維培養中細胞的形貌和伸展面積會導致細胞功能的改變，但三維培養中這些因素是否對細胞的功能產生影響尚未明確[29]。事實上，三維基質中細胞的伸展或擴散很可能與二維平面上發生的過程有很大不同。

結合細胞外環境的結構多樣性，不難想到三維環境中的粘附過程是高度可變的。二維培養中整合素介導的粘附過程包括：板狀偽足伸展，肌球蛋白相關細胞骨架張開，粘著斑強化[30]。整個過程只需很短的時間。然而在三維環境中，細胞必須通過跨越或酶解ECM才能得到伸展，這需要數小時、甚至幾天的時間方能實現，而非數分鐘[31]。Doyle等[32]重現了生物來源基質上的三維粘附過程，發現二維和三維微環境中培養的細胞表面整合素類型有很大不同。有趣的是， Eyckmans等[33]發現，這種三維粘附過程可通過在具有細條形微拓撲結構的二維平面進行細胞培養而重現。

目前，對ECM粘附配體空間分布的研究仍處于起步階段，利用二維技術研發出類似方法，可有效推動三維狀態下對細胞粘附的研究[34]。Levental 等[35]發現，位于細胞底部的ECM中粘附配體的分布會影響細胞的平面極性及有絲分裂紡錘體的產生。不僅如此，研究表明ECM的納米結構對粘附的結構、功能，甚至組成成分都有影響[36]?？紤]到疾病進展過程中各種天然納米基質結構的動態變化，對結構體系的研究就顯得尤為重要[37]。

3.2 力學傳導 普遍認為，力學傳導在細胞間及細胞周圍廣泛存在，這些應力在控制細胞的結構及功能上發揮了重要的作用[38-39]。早期有研究分別將細胞置于貼壁水凝膠(固定的)中及分離的可收縮凝膠(浮動的)中進行培養，進而發現了ECM對細胞的力學作用，如乳腺上皮細胞腺泡和小管只形成于浮動的凝膠中[40]，提示三維培養可能會影響機械應力及其在細胞中的傳導通路。

傳統的二維培養在玻璃或塑料等材料上進行，細胞置于一種超生理硬度的靜態力學環境中。在意識到人工培養環境和組織微環境之間巨大的差異后，研究者利用柔軟的凝膠進行研究，發現ECM的機械硬度對細胞粘附、形態、以及干細胞分化及維持有一定影響[41]。柔軟的結構特性并不是三維培養環境的固有特性，但卻是三維培養體系的一種共有特點，因此在研究二維與三維培養中細胞行為的差異時，應將這個因素考慮在內。細胞感應機械硬度的具體機制仍不清楚，但目前大部分研究這種機制的方法均基于二維培養，而細胞在二維平面中感應硬度的機制與在三維微環境中不盡相同。Huebsch等[42]通過證實三維RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)海藻酸凝膠中間充質干細胞(MSC)的分化，驗證了凝膠硬度對細胞行為會產生一定的影響作用，并且MSC的分化表現出雙重效應，在凝膠達到一個中界硬度時骨生成發生最大化，而在二維環境中達到穩定水平。利用FRET成像系統觀察細胞-ECM的相互關系，研究者同樣發現，三維基質材料中骨發生需要細胞通過牽引力聚集整合素，且這種聚集在過硬的三維基質中會停止，而在二維介質中尚未發現[42]。

除了被動傳感ECM的柔韌度等信號，細胞通常主動負載一些諸如力學傳導和轉換的信息[38]。盡管目前尚不清楚外來應力和內生力是否通過常見的機械傳導通路被細胞感知[43]，但在二維和三維基質中細胞感應作用力的機制明顯不同。二維培養中研究細胞的拉伸變形是在光滑和均勻的平面進行，細胞發生的形態變化是可預見的。相比之下，大部分三維基質是纖維性的，因而結構具有非均質性、各向異性[44]。作用力以何種形式傳遞給細胞取決于與細胞接觸的基質纖維的比例和構成，以及細胞是否直接固定和或受到材料的限制。例如，位于纖維軟骨內的鄰近細胞，與膠原纖維的遠近及粘連情況的差異也會導致伸展的程度不盡相同[45]。

3.3 效應分子的轉運 營養物質、氣體分子(如氧氣、二氧化碳)及可溶性分子(如生長因子、激素、細胞因子)等眾多的效應分子對一些基本的細胞行為，如遷移、定位、血管生成及組織結構整合等至關重要[46-48]，但在組織中這些分子的空間分布較為復雜，常由ECM的結構及孔隙率、有無血管或細胞的分布等多方面因素共同參與調節。

在傳統的二維培養模式中，由細胞分泌的或外在添加的可溶性因子通過充分混合、自由擴散便可快速均衡分布。因此可在二維培養體系中研究一些短暫動態的細胞行為變化，但觀察長期的、與形態變化相關的過程，則需要該培養體系中與細胞生長有關的效應分子能維持數小時甚至數天的時間。不管是通過建立三維培養體系，還是僅在二維培養平面上覆蓋三維基質模擬出ECM結構，都會減慢體系中可溶性分子的轉運和平衡過程，并且維持這種梯度分布的穩定，如無ECM的球狀細胞團就是一種相對簡單的三維模型，可捕捉一定半徑內生物因子的分布梯度，而位于腫瘤細胞團中的缺氧壞死區域，被證實有利于研究氧在腫瘤形成及耐藥中的作用[49]。

當細胞置身于三維微環境中，基質或支架的結構特性如孔徑、纖維連接等均可調節可溶性因子的擴散[50]。通過觀察μm級和mm級凝膠中肝細胞生長因子(HGF)對MDCK細胞的作用差異，研究者發現相關信號傳導的時間及層面與HGF的擴散率密切相關，而與HGF所處的空間狀態無關[50]。盡管體外三維培養經常忽略生物分子的擴散對細胞行為的影響，但可溶性效應因子擴散的差異有時也會引起一些意想不到的細胞行為發生。Nelson等[51]發現了一種具有抑制作用的形態因子，能夠以自分泌的方式對三維μm級表皮組織中血管的出芽進行精確定位。此外，利用三維組織中氧氣的分布，可準確的對細胞代謝活躍區、缺氧區甚至死亡區域進行定位[52]。

效應分子的空間分布除了受擴散因素的影響外，壓力的分布梯度和大規模組織變形也可影響細胞間質的流體流動及對流運輸。實際上，作用力之間的耦合和溶質的運輸可能是三維環境下力學信號轉換為細胞信號的另外一種重要手段[53]。除此之外，ECM還能有效隔絕可溶性因子。研究證明，硫酸肝素蛋白聚糖可與ECM中的生長因子活躍地結合，轉化生長因子β也與IV型膠原的存在有著密切關系[54]。ECM中各種生物因子在時間及空間水平的儲存與釋放很可能是控制細胞行為的重要機制。這些因子會通過一系列機制如蛋白水解酶降解基質[55]，細胞的機械牽引等主動釋放[56]，這也提示調節相關生物因子的釋放至少有兩條以上的信號傳導途徑。

4 展望

隨著藥物篩選和器官模型的研發，以及組織工程、再生醫學的發展，在更接近體內生理狀態的三維培養模型中驗證二維培養體系的研究結果，將推動細胞生物學領域的發展。忽略空間的非特異性差異，深入研究培養微環境的內在作用機制，才是揭示預期結果的關鍵途徑。未來主要研究的主題在于：細胞粘附的結構、成分及其三維分布如何改變細胞形貌、骨架結構，進而影響細胞的信號轉導及相應的細胞功能；三維ECM中的力學傳導如何與平面培養物或柔軟的凝膠支架發生相互作用；支架或基質材料的化學及物理結構如何改變細胞生長所需各種物質的運輸及利用率等。

為模擬細胞粘附、力學及化學因素對細胞功能的調節作用，三維培養過程中還會有更復雜的現象發生，而細胞對此的自然反應是結構的改變。形態變化、組織重塑和細胞遷移等行為也會改變三維組織微環境，二維培養系統中卻難以重現這些過程。即便是簡單的細胞行為，二維和三維狀態下也有顯著的差異。例如，二維基質中的細胞遷移通過幾個迭代過程：前端擴展、粘連形成、發生牽引和隨后尾緣的收縮。相比于這些既定的過程，細胞在三維環境中的遷移方式取決于基質的結構、成分及力學特性等[44]。因此，研究細胞遷移等過程的模型仍在不斷探索中。

總之，體外細胞培養模型和天然組織環境之間不僅僅是二維平面與三維空間的差異。研究微環境中細胞粘附、力學傳導及效應分子的作用機制，并明確它們在二維、三維培養時與體內相比在調節機制上的異同最為重要。這不僅有助于研究者更好地將微環境培養組織工程化，從而更準確地捕捉到細胞在體內生存的真實場景，也有助于進一步充分利用細胞功能。然而，忽略ECM是起源于細胞，只討論細胞微環境及其對細胞行為的調控是不科學的，不管是二維還是三維培養都只是在初始條件下進行調控，還應該考慮細胞和ECM的雙重關系和作用。

[參考文獻]

[1] Kartsen T A, Shahdadfar A, Brichmann J E. Human primary articular chondrocytes,chondroblasts- like cells, and dedifferentiated chondrocytes: differences in gene, microRNA, and protein expression and phenotype[J]. Tissue Eng Part C Methods, 2011, 17(2): 219-227.

[2] O'Dea R D, Osborne J M, El Haj A J, et al. The interplay between tissue growth and scaffold degradation in engineered tissue constructs[J]. J Math Biol, 2013, 67(5): 1199-1225.

[3] Bissell M J, Weaver V M, Lelievre S A, et al. Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast[J]. Cancer Res, 1999, 59(Supp1): 1757-1764.

[4] Catalano V, Turdo A, Di Franco S, et al. Tumor and its microenvironment: a synergistic interplay[J].Semin Cancer Biol, 2013, 23(6 Pt B): 522-532.

[5] Teicher B A,Herman T S,Holden S A, et al. Tumor resistance to alkylating agents conferred by mechanisms operative onlyinvivo[J]. Science, l990, 247(4949 ):1457-1461．

[6] Kobavashi H, Man S, Graham C H, et al．Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(8): 3294-3298．

[7] Xu X, Farach-Carson M C, Jia X. Three-dimensionalinvitrotumor models for cancer research and drug evaluation[J]. Bio Tech Adv, 2014,7(9) :1-13.

[8] Kuriwaka M, Ochi M, Uchio Y,et al.Optimum combination of monolayer and three- dimensional culture for cartilage-like tissue engineering[J]. Tissue Eng, 2003, 9 (1): 41 - 49.

[9] East J L, Knesek J E, Chan J C, et al. Quantitative nucleotide sequence relationships of mammalian RNA tumor viruses[J]. J Virol, 1975, 15(6): 1396-1408.

[10] 滕偉, 郭志坤. 細胞三維培養的研究進展[J]. 醫學綜述,2008, 14 (12): 1767-1770.

[11] Masuda K, Sah R L, Hejna M J. A novel two-step method for the formation of tissue- engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate- ecovered- hondrocyte (ARC) method[J]. J Orthopaedic Res, 2003, 21(1):139 - 148.

[12] Hoffman A S. Hydrogels for biomedical applications[J].Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(1):3-12.

[13] 韓云竹, 宋鴻. 藻酸鹽凝膠中肝癌HepG2細胞的三維培養[J]. 遵義醫學院學報, 2014, 37(2):215-218.

[14] 宋鴻, 陳煒. 兔軟骨細胞在藻酸鹽凝膠中體外培養[J]. 遵義醫學院學報,2009,32(1) :20-22.

[15] Langer R, Vacanti J P. Tissue engineering[J].Science, 1993, 260 (5110): 920-926.

[16] Yannas I. Tissue and organ regeneration in adults[M]. New York: Springer, 2001.

[17] Buchanan C F, Voigt E E, Szot C S, et al. Three dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization[J]. Tissue Eng,2014,20(1):64-75.

[18] Schmeichel K L, Bissell M J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions[J]. J Cell Sci, 2003, 116(12): 2377-2388.

[19] Benton G, Arnaoutova I, George J, et al. Matrigel:from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research[J]. Adv Drug Deliv Rev,2014,6(5):1-16.

[20] Holmes T C, de Lacalle S, Su X, et al. Extensive neurite outgrowth and active synapse formation on self-assembling peptide scaffolds[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2000, 97(12): 6728- 6833.

[21] Mata A, Hsu L, Capito R, et al. Micropatterning of bioactive self-assembling gels[J]. Soft Matter, 2009, 5(6): 1228-1236.

[22] Sun L, Zhao X. A self-assembling peptide RADA16-I integrated with spider fibroin uncrystalline motifs[J]. Int J Nanomedicine，2012, 7(2): 571-580.

[23] Weber G F, Bjerke M A, DeSimone D W. Integrins and cadherins join forces to form adhesive networks[J]. J Cell Sci, 2011, 124(8): 1183-1193.

[24] Guarner A, Manjón C, Edwards K, et al. The zinc finger homeodomain-2 gene of Drosophila controls Notch targets and regulates apoptosis in the tarsal segments[J]. Dev Biol, 2014, 385(2): 350-365.

[25] Littlepage L E, Sternlicht M D, Rougier N, et al. Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcinogenesis, metastasis, and angiogenesis progression[J]. Cancer Res, 2010, 70(6): 2224-2234.

[26] Meyers J, Craig J, Odde D J. Potential for control of signaling pathways via cell size and shape[J]. Curr Biol,2006,16(17):1685-1693.

[27] Mahmud G, Campbell C J, Bishop K J, et al. Directing cell motions on micropatterned ratchets[J]. Nat Phys, 2009, 5(8): 606-612.

[28] Kilian K A, Bugarija B, Lahn B T, et al. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(11): 4872-4877.

[29] DeForest C A, Polizzotti B D, Anseth K S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments[J]. Nat Mater, 2009, 8(8): 659-664.

[30] Khetan S, Burdick J A. Patterning network structure to spatially control cellular remodeling and stem cell fate within 3-dimensional hydrogels[J]. Biomaterials, 2010, 31(32): 8228-8234.

[31] Geiger B, Spatz J P, Bershadsky A D. Environmental sensing through focal adhesions [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(1): 21-33.

[32] Doyle A D, Wang F W, Matsumoto K, et al. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration[J]. J Cell Biol, 2009, 184(4): 481-490.

[33] Eyckmans J, Boudou T, Yu X, et al. A hitchhiker's guide to mechanobiology[J]. Dev Cell, 2011, 21(1): 35-47.

[34] Klein F, Richter B, Striebel T, et al. Two-component polymer scaffolds for controlled three-dimensional cell culture[J]. Adv Mater, 2011, 23(11): 1341-1345.

[35] Levental K R, Yu H, Kass L, et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling[J]. Cell, 2009, 139(5): 891-906.

[36] Kubow K E, Horwitz A R. Reducing background fluorescence reveals adhesions in 3D matrices[J]. Nat Cell Biol, 2011, 13(1): 5-7.

[37] Harunaga J S, Yamada K M. Cell-matrix adhesions in 3D[J]. Matrix Biol, 2011, 30(7-8): 363-368.

[38] Hoffman B D, Grashoff C, Schwartz M A. Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction[J]. Nature, 2011, 475(7356): 316-323.

[39] Orr A W, Helmke B P, Blackman B R, et al. Mechanisms of mechanotransduction [J]. Dev Cell, 2006, 10(1): 11-20.

[40] Keely P J, Fong A M, Zutter M M,et al. Alteration of collagen-dependent adhesion, motility, and morphogenesis by the expression of antisense alpha 2 integrin mRNA in mammary cells[J]. J Cell Sci, 1995, 108(pt2): 595-607.

[41] Gilbert P M, Havenstrite K L, Magnusson K E, et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture[J]. Science, 2010, 329(5995): 1078-1081.

[42] Huebsch N, Arany P R, Mao A S, et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate[J]. Nat Mater, 2010, 9(6): 518-526.

[43] Pathak A, Kumar S. Biophysical regulation of tumor cell invasion: moving beyond matrix stiffness [J]. Integr Biol (Camb), 2011, 3(6): 267-278.

[44] Bridgen D T, Gilchrist C L, Richardson W J, et al. Integrin-mediated interactions with extracellular matrix proteins for nucleus pulposus cells of the human intervertebral disc[J]. J Orthop Res, 2013, 31(10): 1661-1667.

[45] Kay R R, Langridge P, Traynor D, et al. Changing directions in the study of chemotaxis[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008, 9(6): 455-463.

[46] Adams R H, Alitalo K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(6): 464-478.

[47] Bollenbach T, Pantazis P, Kicheva A, et al. Precision of the Dpp gradient[J]. Development, 2008, 135(6): 1137-1146.

[48] Legant W R, Miller J S, Blakely B L, et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices[J]. Nat Methods, 2010, 7(12): 969-971.

[49] Hirschhaeuser F, Menne H, Dittfeld C, et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again[J]. J Biotechnol, 2010, 148(1): 3-15.

[50] Raghavan S, Shen C J, Desai R A, et al. Decoupling diffusional from dimensional control of signaling in 3D culture reveals a role for myosin in tubulogenesis[J]. J Cell Sci, 2010, 123(17): 2877- 2883.

[51] Nelson C M, Vanduijn M M, Inman J L, et al. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures[J]. Science, 2006, 314(13): 298-300.

[52] Volkmer E, Drosse I, Otto S, et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone[J]. Tissue Eng Part A, 2008, 14(8): 1331-1340.

[53] Vernerey F J, Farsad M. A constrained mixture approach to mechano-sensing and force generation in contractile cells[J].J Mech Behav Biomed Mater, 2011, 4(8): 1683-1699.

[54] Li Y C, Ding X S, Li H M, et al. Icariin attenuates high glucose-induced type IV collagen and fibronectin accumulation in glomerular mesangial cells by inhibiting transforming growth factor-β production and signalling through G protein-coupled oestrogen receptor[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013, 40(9): 635-643.

[55] Merulla J, Fasana E, Soldà T, et al. Specificity and regulation of the endoplasmic reticulum- associated degradation machinery[J]. Traffic, 2013, 14(7): 767-777.

[56] Liu Z, Tan J L, Cohen D M, et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(22): 9944-9949.