山羊肺泡巨噬細胞分離培養及脂多糖誘導形態學觀察

惠文巧，班 謙，湯繼順，侯宏艷，陳 勝

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，合肥 230031；2.安徽大學生命科學學院，干細胞及轉化醫學研究中心）

山羊肺泡巨噬細胞分離培養及脂多糖誘導形態學觀察

惠文巧1，班 謙2，湯繼順1，侯宏艷1，陳 勝1

（1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所，合肥 230031；2.安徽大學生命科學學院，干細胞及轉化醫學研究中心）

肺泡巨噬細胞是宿主天然免疫和特異性免疫的重要執行者。目前關于山羊肺泡巨噬細胞體外分離培養的方法尚未見報道。文章從健康無病變的羔羊肺臟灌洗液中分離肺泡巨噬細胞，并加50 μg/mL的脂多糖進行誘導刺激。結果顯示：肺泡巨噬細胞分離純度較高，不發生增殖，體外可維持30 d左右，經脂多糖誘導細胞出現聚集和增大現象。表明山羊肺泡巨噬細胞體外維持時間較長，脂多糖誘導實驗初步證實其具備免疫學功能，為進一步利用山羊肺泡巨噬細胞進行免疫學機制研究和疾病治療提供了依據。

山羊；肺泡巨噬細胞；分離培養；脂多糖

肺泡巨噬細胞作為單核-巨噬細胞成員之一，是由血液中單核細胞遷移到肺泡間隔后演變而來［1］。它是肺部最早接觸病原微生物的免疫防御細胞之一，具有多種生物學功能，是宿主天然免疫和特異性免疫的重要執行者。在非特異性免疫中，肺泡巨噬細胞能夠吞噬、清除自呼吸道侵入機體的外源微生物，同時還可介導炎性反應；在特異性免疫方面，主要發揮免疫調節功能［1-3］。作為肺臟抗病原感染的首道防線，肺泡巨噬細胞是研究機體自然感染和獲得性免疫的良好模型。

目前，有關肺泡巨噬細胞分離培養方法的報道多見于小型哺乳動物，如小鼠［4-6］、大鼠［7］等，在大型家畜如綿

羊［8］、豬［9-11］、牛［12］、水牛［13］也有報道，而關于山羊肺泡巨噬細胞的分離培養尚未見報道。本研究通過分離山羊肺泡巨噬細胞，同時用脂多糖誘導觀察其形態變化，為后期建立山羊肺炎支原體感染肺泡巨噬細胞模型及其免疫學機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 實驗羊為2月齡健康羔羊，購自合肥市肥東縣富旺鎮某養殖戶。

1.1.2 試劑 特級胎牛血清（FBS）、DMEM、0.25%胰酶、青鏈霉素、PBS均為GIBCO公司產品。培養液配制為10%完全培養液：DMEM/F12培養液44 mL+胎牛血清5 mL+雙抗（1萬單位）1 mL；凍存液：70%DMEM/F12培養液+20%胎牛血清+10%二甲基亞砜。

1.1.3 儀器設備 CO2培養箱（ThermoScientific，美國），生物安全柜（AB2-4S1，ESCO，新加坡），熒光顯微鏡（BX53，OLMPUS，日本）。

1.2 方法

1.2.1 山羊肺泡巨噬細胞分離 處死實驗羔羊，置于無菌解剖臺上，剖開胸腔，經肉眼觀察肺臟健康無病變后，結扎氣管，取出帶氣管的完整肺臟，用含有青鏈霉素的PBS清洗肺臟表面，清除血塊等污物；同時用50 mL注射器通過氣管注入PBS至肺部，輕輕拍打并按摩肺臟表面5 min，同上重復灌洗2次，輕輕拍打肺臟后靜置2 min，收集100 mL灌洗液，用單層無菌100目不銹鋼細胞篩過濾，收集灌洗液后15 000 r/min離心5 min，留沉淀。再用含有雙抗的PBS清洗，10 000 r/min離心5 min，留沉淀，即得肺泡巨噬細胞。

1.2.2 細胞計數 取1 mL細胞懸液與1 mLpH值7.4的PBS溶液混勻，1 min后在血細胞計數板上進行計數，計算山羊肺泡巨噬細胞數量。

1.2.3 原代細胞培養 加入10%胎牛血清的DMEM培養液（加培養液前將培養液在37℃、5%CO2培養箱中預熱10～15 min），將獲得的肺泡巨噬細胞稀釋至整細胞濃度至4×105個/mL，按2 mL/孔接種于6孔培養板，同時將細胞濃度調整為1×106個/mL，置于50 mL培養瓶內，于37℃、5%CO2培養箱中培養8 h。8 h后，從培養箱取出培養瓶和培養板，棄舊培養液，以去掉少數未貼壁的細胞，加入PBS清洗2次，更換10%完全培養液，2 mL/孔，置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養，24 h后更換培養液，以后每72小時換液一次。

1.2.4 脂多糖刺激肺泡巨噬細胞形態學觀察 實驗加入LPS終濃度為50 μg/mL，37℃條件下誘導培養6 h，棄舊培養液后加入PBS洗去未貼壁細胞，用倒置顯微鏡觀察巨噬細胞細胞形態變化及生長狀況，并進行細胞計數。

2 結果

2.1 山羊肺泡巨噬細胞培養特性

由圖1可見，分離到的山羊肺泡巨噬細胞純度較高，均呈圓形、橢圓形狀，有的伸出偽足（圖1-A），未見到梭狀等其他上皮細胞形態，高倍鏡下其形態學尤為明顯，看到典型的突起狀（圖1-B）。整個培養過程中，未出現細胞增殖現象，且細胞在體外培養30 d內均未出現大規模死亡現象。

圖1 山羊肺泡巨噬細胞培養特性

2.2 脂多糖LPS誘導山羊肺泡巨噬細胞形態學觀察

脂多糖LPS誘導山羊肺泡巨噬細胞形態學觀察見圖2。同正常組相比（圖2-B），LPS誘導6 h后，山羊肺泡巨噬細胞生長模式發生了明顯改變，出現聚集和增大現象（圖2-A），部分細胞增大尤為明顯，且細胞數量有所減少。

圖2 LPS誘導6 h后山羊肺泡巨噬細胞形態學觀察

3 討論

3.1 肺泡巨噬細胞分離培養

研究表明，人類和動物氣管肺泡灌洗液中，肺泡巨噬細胞計數最多，可占全部細胞總數的80%［14］。因此，動物實驗獲取肺泡巨噬細胞的關鍵在于肺泡灌洗液的收集。

關于肺泡巨噬細胞的分離，諸多文獻均采用從氣管沖入灌洗液PBS至肺臟，進而收集灌洗液這一方法［8-10］，但具體操作方法和步驟也不盡相同，主要體現在灌洗液的溫度、劑量、清涼程度等，最終導致收集到的含有肺泡巨噬細胞灌洗液的純度和含量出現差異。本實驗提取肺泡巨噬細胞的方法關鍵在于以下幾點：①本實驗采用的是常溫下的PBS灌洗，更接近于動物體溫，從而有利于細胞分離和獲得；②本實驗獲取的肺泡灌洗液清亮，不含血絲及其他膠原粘性組織，這在一定程度上保證了巨噬細胞的純度。獲得的肺泡巨噬細胞經形態學觀察，具有體內巨噬細胞的典型特征，且純度較高，不發生增殖，體外生長可維持30d左右。這可能與以上具體操作方法有關。

3.2 脂多糖誘導形態學觀察

脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分，是細菌最主要的致病毒素，通過與肺泡巨噬細胞表面的TLR4結合啟動炎癥信號級聯反應，釋放各類炎癥因子，從而導致細胞受損［15］。本實驗獲得的肺泡巨噬細胞經脂多糖刺激后，出現大量的巨噬細胞聚集和增大現象，表明巨噬細胞能夠發揮其功能，具有一定的活性。另外，本研究還發現，經脂多糖誘導后，巨噬細胞生長模式發生明顯改變，細胞生長速度下降，細胞數量減少，這與卿城［15］的報道一致。這可能是因為在脂多糖的刺激下，細胞表面釋放各類炎性因子，從而導致細胞受損，其具體作用機制還有待進一步分析。

綜上，本研究獲得的肺泡巨噬細胞純度高、活性好，可為后續建立山羊肺炎支原體感染肺泡巨噬細胞模型及其免疫學機制研究奠定基礎。

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S858.27

A

2095-3887（2014）05-0046-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.014

2014-07-07

安徽省農業科學院博士啟動基金項目；安徽省農業科學院院長杰出青年基金項目（14B0403）

惠文巧(1986-)，女，博士。

陳勝（1974-），男，副研究員，碩士，主要從事肉羊遺傳育種與繁殖技術研究。