酒度、總酸、pH值以及飲用溫度對干紅葡萄酒澀味的影響

楊曉雁，袁春龍*，張 暉，楊 健，張世杰，馬 婧，楊 麗

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

酒度、總酸、pH值以及飲用溫度對干紅葡萄酒澀味的影響

楊曉雁，袁春龍*，張 暉，楊 健，張世杰，馬 婧，楊 麗

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析唾液蛋白與模擬酒反應后蛋白減少比例，并將其表示為澀味強度；同時，以酒度、總酸、pH值以及飲用溫度為考察因素，利用二次正交旋轉組合設計分析各因子對澀味強度的影響。結果表明：pH值對澀度影響最大，其次是酸度和溫度，酒度影響最??；其中pH值和酸度互作效應對澀味的影響顯著。

模擬酒；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；澀味強度；唾液蛋白沉淀指數

紅葡萄酒的澀味是由于酒中的多酚與口腔唾液蛋白結合，形成可溶復合物或沉淀物，從而對口腔表皮細胞產生的收斂緊縮感[1]?？谇恢锌梢栽跊]有味覺接收器的部位感受到澀味的產生，所以通常認為澀味是一種觸覺感受而非味覺刺激[2]。對于多數佐餐酒來說，單寧具有維持酒體結構，增加復雜性和味覺長度的作用，單寧引起的澀味強度是評價干紅葡萄酒口感很重要的依據之一[3]。

紅葡萄酒澀味強度與很多因素有關，如單寧結構、唾液蛋白種類與數量以及葡萄酒基質條件等。單寧分子質量大，立體結構較為疏散，結合蛋白效率高，如以C4～C8鍵結合的單寧整體結構比C4～C6的更線性，結合能力更強，澀味強度更大[4]。唾液蛋白不同成分與單寧的結合效率也不同[5]，蛋白質組學研究發現在唾液中鑒別出437 種蛋白，而與澀味有關的蛋白，主要是富脯蛋白（proline-rich proteins，PRPs），富組蛋白（histidinerich proteis，HRP），胱蛋白酶抑制劑，乳鐵蛋白和α-淀粉酶，其中富脯蛋白，富組蛋白以及α-淀粉酶對澀味貢獻最大[6-7]。除上述因素，影響葡萄酒澀味的還有酒度、總酸、pH值、溫度、殘糖、黏度、酒體氧化程度以及品嘗員個體的差異等[8-9]，都對葡萄酒澀味評價有一定程度的影響。

葡萄酒澀味測定的傳統方法是通過人體感官品嘗來實現，然而感官分析本身存在很多不足之處：由于個人體質的差異會對澀味有不同的敏感性[10]；葡萄酒中存在酸味苦味等復雜的口感都會對澀味有干擾作用；感官品嘗澀味還容易導致口腔疲勞，不易精確感知；酒精灼熱感對澀味感受也有一定干擾作用。另外由于紅酒中的苦澀味彼此之間會發生不良味感的疊加，不易區分苦澀。鑒于上述原因，要對葡萄酒澀味進行評價確實存在一定難度，所以近年來在體外評價澀味的研究受到很多關注。在不同學者提出的多種方法中，使用最為廣泛的是聚丙烯酰胺凝膠電泳[8,10]。

本實驗通過建立感官品嘗與化學分析方法相關關系，確定體外研究方法后，利用二次正交旋轉組合設計，重點探討酒度、總酸、pH值以及飲用溫度對葡萄酒澀味的影響，以及影響因素之間的互作效應。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酒石酸 天津博迪試劑公司；明礬（硫酸鋁鉀）、氫氧化鈉、無水乙醇 天津科密歐公司；兒茶素、牛血清白蛋白 美國Sigma公司；三羥基三乙胺（簡稱三乙醇胺，即triethanolamine（TEA））、氯化鐵、蘆丁、甲醇、氯化鋁、亞硝酸鈉等藥品均為分析純天津光復試劑公司；Tris-HCl（pH 6.8）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、四乙基乙二胺（N,N,N’,N’-tetraethylethylenediamine，TEMED）原液、10%過硫酸銨（用重蒸水新鮮配制）、pH 8.6 Tris-甘氨酸電極緩沖液、0.02%溴酚藍、β-巰基乙醇 北京博沃森試劑公司。

DYY-10C電泳儀、DYC2-24DN垂直電泳槽 北京市六一儀器廠；TS-1000脫色搖床 上海西工儀器廠；凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬酒的配制

根據干紅葡萄酒相關理化指標，配制模擬酒，以3 g/L單寧酸為基礎，選擇酒度梯度為0%、7%～11%、13%、15%（V/V），總酸梯度為0、1、2、4、6 g/L、pH值梯度為 2.5、3.0、3.7、4.0、4.5和飲用溫度梯度為10、18、25、37、45 ℃，用0.45 μm過濾器將配制好的模擬酒進行過濾，室溫保存待用，做單因素試驗以及四因素五水平的正交試驗。

1.2.2 酒樣的準備

抽選10 款實驗用酒樣包括山西鄉寧戎子酒莊2012年品麗珠以及赤霞珠；內蒙古烏海漢森酒莊2008年蛇龍珠和赤霞珠；新疆沙地酒莊2011和2012年赤霞珠；河北昌黎朗格斯酒莊2009和2011年美樂、馬瑟蘭以及馬爾貝克混釀；寧夏賀蘭山酒莊2012年美樂；甘肅嘉峪關紫軒酒莊2010年美樂。

1.2.3 唾液蛋白的制備

選取6 名無口腔疾病不吸煙的志愿者，3男3女，上午10點—11點收集唾液，在收集之前2 h內不吃東西。將唾液收集到冷凍5 min的離心管中，靜置過夜后在10 000×g條件下離心10 min，除去不溶物質，所得上清液為唾液蛋白樣品。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

取50 μL模擬酒樣與100 μL唾液蛋白反應5 min，然后10 000×g離心10 min，取上清溶液再進行SDS-PAGE。

取唾液蛋白原液作為參照，與模擬酒結合后的蛋白溶液作為上樣蛋白，每個樣品重復3 次。分別配制12.5%的分離膠和4%的濃縮膠，開80 V電泳0.5 h，至溴酚藍剛跑出濃縮膠，將電壓換到120 V、1.5 h后，即可停止。電泳之后，凝膠在考馬斯亮藍溶液中進行染色過夜后用脫色液孵育脫色，直到凝膠背景色接近無色為止。

利用Bio-Rad凝膠成像系統采集電泳條帶圖像信息，Quantity One（Bio-Rad，Version 4.6.2）分析軟件進行數據處理。對電泳條帶除背景，進行高斯建模，分析蛋白與模擬酒反應前后蛋白條帶密度減少量，表達為唾液蛋白沉降指數（saliva precipitate index，SPI），用來表示澀度。

1.2.5 葡萄酒多酚指標測定

參照Harbertson等[11]單寧-蛋白沉淀法測定干紅葡萄酒中單寧與多酚含量。準確量取50 g SDS于燒杯中，加50 mL TEA，溶于去離子水中，pH值調為9.4后定容到1 L，標記為Buffer，室溫保存。配制FeCl3-HCl溶液，準確量取0.676 g氯化鐵，加入200 μL濃鹽酸，定容到250 mL。配制1 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液于4 ℃低溫保存。

兒茶素質量濃度梯度范圍為0.05～3 mg/mL，510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。測定過程為取少許酒樣，加入1 mL蛋白標準液，反應15 min后，13 500×g離心5 min；棄去上清液，加入875 μL Buffer靜置10 min，510 nm波長處測定A1。繼續加入125 μL 三氯化鐵溶液，10 min后510 nm波長處測定A2。按照公式（1）計算單寧含量。其結果用兒茶素當量表示。

式中：b、k分別為標線截距和斜率。

式中：A總酚為總酚的吸光度；A0為875 μL Buffer + 125 μL三氯化鐵溶液的吸光度。

根據Jia Zhishen等[12]蘆丁甲醇法測定酒樣類黃酮。取0.1 mL酒樣，依次加入0.9 mL無水甲醇、30%甲醇溶液 2.7 mL、0.5 mol/L的亞硝酸鈉溶液0.2 mL、 0.3 mol/L氯化鋁溶液0.2 mL，振蕩搖勻后靜置5 min，最后加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液 1 mL，搖勻并在510 nm波長處測定吸光度。樣品重復3 次，結果以蘆丁當量表示（mg/L）。

1.2.6 感官培訓

感官品嘗小組成員由12～15 名接受過專業感官培訓的學生及老師組成，年齡在20～36 歲之間。首先，選取2 g/L明礬溶液，0.1 g/L硫酸奎寧溶液，4 g/L酒石酸溶液分別訓練識別澀味、苦味和酸味。品嘗員將液體倒入口中至少保持8 s吐出，描述感受，兩樣品間需要充分休息，多次漱口或咀嚼無味蘇打餅干，使味覺恢復。然后利用線性標記法[13]（即在一條100 mm的線段上，根據品嘗結果在線上標出感受到的強度，規定不添加任何物質的水溶液強度為零，對明礬溶液而言2.0 g/L為澀度最強，澀味強度標記到100，最后根據所標記位置與原點距離長短定義強度大?。?，對質量濃度梯度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的明礬標準溶液進行反復線性定位，討論后確定澀味強度在直線上大致的位置。對不同溶液進行澀味定量分析時，以標準溶液為參照對象，在直線上標出位置，確定其澀味強度。在測試樣品時，做3 次重復。

1.2.7 正交試驗設計

根據葡萄酒各理化指標，以及單因素試驗結果，選取酒度、總酸、pH值和溫度四因素的考察水平。用DPS7.55軟件進行二次正交旋轉組合設計。

2 結果與分析

2.1 不同方法評價澀味相關性

表1 不同方法對澀味相關性的評價分析Table1 Correlation analysis

測定葡萄酒中總酚、單寧以及類黃酮等多酚指標，建立與感官分析相關性。利用SPSS17.0分析感官評價的澀味強度和電泳分析SPI的Pearson相關性，結果如表1所示。單寧含量與感官評價結果顯著相關，電泳分析結果極顯著相關，其他指標與感官評價相關性較差。

發送端3種狀態中均對應著同步機制,CGS狀態對應碼組(字節)同步,ILAS狀態對應初始通道同步,DATA狀態則對應用戶數據傳輸過程中的幀/多幀同步。其中sync信號是接收端反饋給發送端的關于同步完成的指示信號。

2.2 SDS-PAGE分析

電泳結果利用Quantity One進行分析，選擇分子質量靠近Marker 66.2、31、22、14.4 kD的4個主要蛋白作為分析蛋白[14]。由于對葡萄酒澀味起主要作用的蛋白是富脯蛋白和α-淀粉酶，這兩類蛋白分別在15 kD和62～59 kD附近，在早期研究中，常用這兩種蛋白代表全部的人類唾液蛋白[15]，可見其重要性。

圖1 單因素試驗電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis maps

由圖1可知，酒度為0%～15%，pH 2.5～4.5，溫度10～45 ℃等因素梯度作用，結果蛋白灰度呈現增加趨勢，總酸質量濃度0～6 g/L，蛋白灰度呈降低趨勢。因此因素梯度水平能夠引起蛋白含量發生顯著變化，可用此梯度范圍進行正交試驗作進一步的分析。

2.3 建立澀味回歸模型

Quantity One數據分析后，獲得各因素對紅葡萄酒中澀味影響的試驗結果，利用DPS7.55對試驗數據（表2）進行擬合，獲得以下回歸方程：

表2 二次正交旋轉回歸組合設計及結果Table2 Orthogonal rotation combination design and results

2.4 二次回歸模型顯著性分析

由表3可知，模擬酒中澀度回歸方程的回歸性P=0.000 2＜0.01，說明回歸方程的回歸性水平極顯著。對回歸系數進行顯著性檢驗，在α=0.1顯著水平剔除不顯著項后可以得到優化方程為：Y= 85.883 3-4.419 17X2-

表3 試驗結果方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal rotation combination design

2.5 單因素與雙因素效應結果

分析酒度、總酸、pH值和溫度4 個單因素在不同研究水平下對SPI的影響，可以通過規定其他3 個因素置于零水平而得到另一因素對澀味強度的影響規律，結果見圖2。

圖2 各因素與澀味的關系Fig.2 Relationship between each variable and astringency

由圖2可知，總酸對澀度的影響呈現開口向下的拋物線趨勢，隨著總酸增加，澀度先緩慢升高后，較大幅度降低。pH值對澀味強度影響與總酸相近，也存在極大值，隨著pH值升高，澀味強度先迅速增大后緩慢下降。酒度對澀度的影響不太明顯，幾乎持平。溫度升高，澀度增加，但增加趨勢表現平緩，斜率絕對值較小。

由表3可知，雙因素間X1X2、X1X3、X1X4、X2X4和X3X4的P值都大于0.05，只有X2X3的P值小于0.05，即表示總酸和pH值間的交互作用比較顯著，而其他因素間的交互作用都不顯著，因此，雙因素間的互交作用不明顯。

3 討 論

通過分析不同總酸、pH值、酒度和溫度對干紅葡萄酒澀味強度的影響，pH值改變對澀味強度作用較大，此結論與Fontoin[16]和Lawless[17]等的結論一致。pH值體現的是酒體中游離氫離子水平，在酸性環境中唾液蛋白結構改變，暴露出更多的多酚結合點，所以二者結合效率提高[18]，澀味強度從而增大。pH值較低時，氫鍵結合還會促進單寧自身結合，而形成類似蛋白-單寧復合物，也會增加口腔中的澀味[19]。另外，氫離子濃度高，多酚物質通過疏水作用可以在蛋白表面形成一層膜，使之親水性降低，從而產生多酚-蛋白復合物。酒體pH值較高時，帶電的酚鹽離子比例高，帶電物質不能參與氫鍵的形成，由于多酚與蛋白結合主要依靠氫鍵和疏水作用力，因此二者結合比例降低[20]。對于干紅葡萄酒而言，酸性物質主要是酒石酸，還有少量蘋果酸和檸檬酸。酸性物質本身帶有一定澀味，濃度增大時，自身澀味與單寧澀味相互疊加，從而對葡萄酒整體澀味存在一定促進作用[21]。在葡萄酒中添加有機酸和無機酸對澀味都有促進作用。在本研究中發現總酸會促進葡萄酒澀味的體現。研究表明，乙醇會修飾蛋白折疊，可能會引發蛋白構象改變，從而干擾蛋白與多酚的反應，所以乙醇有助于柔化多酚澀味[22-23]。但本實驗中沒有明顯的升降趨勢，可能是由于在模擬酒中成分較為簡單，對多酚和蛋白作用較弱。最后，從熱力學角度分析，溫度增加、離子強度增加能夠促進疏水作用力[24]。增加溫度會打開蛋白肽鏈，蛋白表面的疏水面暴露比例增加，促進多酚結合到蛋白表面[25]。溫度越低，酒的澀味越重，香氣更收斂，而低溫有助于多酚的表現力，增加其苦澀味，但溫度的升高會加快葡萄酒的氧化反應，使口感變得圓潤和柔和[26-27]，這與本實驗結論一致。

本實驗主要是對唾液蛋白中分子質量大小不同對蛋白多肽進行分離，不同多肽對多酚親和力各異，分別分析其減少比例，進而描述澀味。而早期用牛血清白蛋白做為結合多酚的標準蛋白物質[28-29]，但特異性不如唾液蛋白。在體外研究澀味的不同方法中，對唾液蛋白進行SDS-PAGE可以更為真實地反映出口腔對澀味的感受。

本實驗擬通過對干紅葡萄酒在體外進行澀味評價，建立與感官評價的相關關系，從而進一步利用模擬酒來探討葡萄酒條件對澀味的影響，首次將SDS-PAGE分析方法與二次正交旋轉回歸方法結合，對葡萄酒澀味影響因素進行綜合探討，期望在釀酒過程中通過調節葡萄酒某些指標來改善口感提高質量，并為以后進一步的研究提供理論基礎。

4 結 論

根據二次正交旋轉回歸的優化試驗結果，可以得到pH值、總酸、溫度、酒度4個因素對葡萄酒澀味強度的回歸方程：Y=85.883 3-1.446 67X1-4.419 17X2+該模型中的pH值和總酸影響效應達到了極顯著水平（P＜0.01），而酒度和溫度的影響效應不顯著（P＞0.05）。并且可以從各因素對應的回歸系數的絕對值可推測對澀味的影響次序為pH值＞總酸＞溫度＞酒度，即pH值對酒中澀味的影響最大，其次是總酸和溫度，對澀味影響最小的是酒度。干紅葡萄酒中基質條件之間的相互作用而導致澀味強度發生改變，利用SDSPAGE體外定量對葡萄酒的澀味進行測定，對于客觀評價葡萄酒質量有重要的參考意義。

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Effects of Ethanol, Total Acid, pH and Drinking Temperature on the Astringency of Dry Red Wine

YANG Xiao-yan, YUAN Chun-long*, ZHANG Hui, YANG Jian, ZHANG Shi-jie, MA Jing, YANG Li
(College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Astringency is a complex sensation mainly caused by the precipitation of salivary proteins with polyphenols. In wine, astringency can be enhanced or reduced depending on the compositions of the medium. Reduced proportion of human saliva protein after reaction with model wine was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE), and expressed as astringency intensity. Furthermore, the effects of three parameters including ethanol, total acid, pH, and drinking temperature on astringency intensity were studied by quadratic orthogonal rotation combination analysis. The results showed that pH had the greatest inf l uence on astringency, followed by total acid and temperature, while ethanol had little impact on astringency. The effect of interaction between pH and total acid was signif i cant.

model wine; sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE); astringency intensity; saliva precipitation index

TS26

A

1002-6630（2014）21-0118-06

10.7506/spkx1002-6630-201421023

2013-11-18

西北農林科技大學科技創新重點項目（ZD2013017）

楊曉雁（1988—），女，碩士，研究方向為葡萄酒化學。E-mail：yang295801145@163.com

*通信作者：袁春龍（1969—），男，副教授，博士，研究方向為葡萄酒化學。E-mail：yuanchl69@nwsuaf.edu.cn