自然發酵乳及傳統開菲爾粒中酵母菌的多樣性研究

李 艷，范 佳

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊 050018）

自然發酵是借助于環境中的微生物使牛乳發酵，將糖與蛋白質等物質轉化為乳酸、酒精等其他風味物質。自然發酵中的酵母菌不僅對乳糖的利用和蛋白質的分解起重要的作用，同時可與乳酸菌有共生作用產生豐富的氨基酸與醇類物質［1］。開菲爾粒是開菲爾的傳統發酵劑，是多種微生物的互生體系，主要由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等構成［2］。乳酸菌分解乳糖產生葡萄糖和半乳糖，促使酵母菌生長而引起乙醇發酵并產生CO2

［3］；酵母菌的生長繁殖為乳酸菌和醋酸菌的生長起促進作用。開菲爾粒特殊的菌群構成賦予了開菲爾制品特殊的口感和香氣風味特征［4］。開菲爾制品中含有50%的黏性多糖（m（葡萄糖）∶m（半乳糖）=1∶1）、少量脂肪、蛋白質、水和其他成分［5］。開菲爾粒中酵母菌的種類和數量致使發酵乳制品的品質不同，當乳糖發酵型酵母菌數達到105CFU／m L時，才能賦予乳制品特有的乳酒風味。2000年，GADAGA等從津巴布韋傳統發酵乳中分離出釀酒酵母、假絲酵母等多種酵母菌［6］。2010年，FADDA等從撒丁島山羊乳中分離出誕沫假絲酵母［7］。目前，中國對于發酵型乳制品微生物的研究大多為乳酸菌，研究可發酵低度乳酒酵母菌的文獻較少。本研究是從自然發酵乳和內蒙古牧區傳統發酵劑開菲爾粒中分離篩選酵母菌，并進行酵母菌的形態聚類和分子鑒定，探尋酵母菌的多樣性和主要菌群的種屬類型，為篩選可發酵低度乳酒的酵母菌奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原材料

1.1.1 原料

1）市售鮮牛乳：購于河北省石家莊市南栗村農戶；

2）商品滅菌乳：購于河北科技大學大學商城國大超市，分別由伊利、蒙牛和君樂寶乳業公司生產；

3）開菲爾粒：取自內蒙古牧區牧民家中，4℃冰箱貯存于滅菌牛乳中。

1.1.2 培養基

YEPD 培養基，WL培養基［8］。

1.1.3 試劑

TaqDNA聚合酶，d NTP，限制性內切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ，合成引物：引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）均購于上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；SW-CJ-1BU潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；DP-200生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；QL-901漩渦振蕩器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；S1000 PCR擴增儀、XR＋凝膠成像分析儀（北京元業伯樂科技發展有限公司）；DYY-8C型穩壓穩流電泳儀、DYCP-310水平式電泳槽（北京市六一儀器廠）；XS-212-202雙目顯微鏡（JMOEC）配有單反相機D5100（尼康映像儀器銷售有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理與酵母菌的分離

1.3.1.1 自然發酵乳的制備與酵母菌的分離

以鮮牛乳為對照樣，分別將商品滅菌乳和鮮牛乳各20 m L置于100 m L三角瓶內進行發酵為1號樣；用檸檬酸調節p H值至4.5后再發酵為2號樣；用檸檬酸調節p H值至4.5并添加2 g蔗糖后再發酵為3號樣。發酵條件為28℃，3～4 d。分別取發酵后的樣品1 m L進行10倍梯度稀釋，取稀釋梯度為10-3～10-5的稀釋菌液0.2 m L（菌落數控制在30～300 CFU／m L）涂布于YEPD培養基中，28℃恒溫培養24～48 h［9］，每個樣品做3個平行。依據菌落觀察挑取不同形態的酵母菌再劃線于新鮮的WL培養基上，進行純化培養，將分離得到的酵母菌用25%（體積分數）甘油冷凍保藏于-20℃冰箱，備用。

1.3.1.2 開菲爾粒的活化與酵母菌分離

開菲爾?！尤霚缇Ｈ椤?8℃培養24 h→過濾→再加入滅菌牛乳→28℃培養24 h，連續活化3次［10］。

取活化增殖培養后的開菲爾粒1 g，于10 m L無菌生理鹽水中研磨，再取1 m L樣品進行10倍梯度稀釋，取稀釋梯度為10-4～10-6稀釋菌液0.2 m L（菌落數控制在30～300 CFU／m L）涂布于YEPD培養基中，28℃恒溫培養24～48 h，每個稀釋度做3個平行。酵母菌分離和純化的方法與自然發酵乳相同。

1.3.2 酵母菌的形態聚類分析

酵母菌的形態聚類采用菌落形態和細胞顯微形態結合分析的方法。將冷凍保藏的酵母菌取出活化，再將單菌落劃線于WL培養基上28℃培養4 d。依據菌落和細胞形態的不同特征予以區分。菌落特征包括：菌落形態、色澤、濕潤程度、表面是否光滑、邊緣是否整齊等。細胞顯微特征包括：細胞形狀、大小、生長繁殖方式、是否有假菌絲等。

1.3.3 酵母菌的分子鑒定

1.3.3.1 酵母菌DNA提取

酵母菌DNA提取采用SDS裂解法［11］。

1.3.3.2 酵母菌5.8S r DNA-ITS區PCR擴增及反應程序

PCR反應體系（50μL）：引物ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）各2μL；d NTP 1μL；Colorless Go Taq Reaction Buffer 10μL；TaqDNA 聚合酶0.35μL；模板DNA 1μL；雙蒸水33.65μL。

PCR反應程序：95℃預變性7 min；95℃變性1 min，52℃退火2 min，72℃延伸2 min，循環35次；再72℃延伸10 min。

PCR擴增產物用質量分數（下同）2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，控制電壓在70 V。

1.3.3.3 酵母菌5.8S r DNA-ITS區PCR擴增產物限制性內切酶酶切

將酵母菌5.8S r DNA-ITS區PCR擴增產物利用3種限制性內切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ進行酶切。

酶切反應體系（20μL）：10×Buffer 2μL，PCR產物8μL，限制性內切酶1μL，雙蒸水9μL。

酶切反應條件：37℃水浴2.5 h。

PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，控制電壓在90 V。

1.3.3.4 酵母菌5.8S r DNA-ITS區序列分析

將酶切后的酵母菌5.8S r DNA-ITS區域PCR產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司，委托其進行基因序列測定。

1.3.4 數據處理

雙向基因序列測序結果經過拼接后，在Genbank核酸序列數據庫中通過Blast（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／Blast.cgi）進行同源序列搜索，比較提交菌株與已知序列菌株的相似程度，以相似度大于99%時確定其屬和種，初步確定酵母菌株的分類學地位。

2 結果與分析

2.1 樣品預處理與酵母菌的分離

從鮮牛乳、自然發酵乳和開菲爾粒中共分離得到130株酵母菌，其中鮮牛乳和自然發酵乳中分離到87株，開菲爾粒中分離到43株，分別占各自所分離總微生物菌數的2.86%和6.64%，開菲爾粒中酵母菌所占比例明顯高于自然發酵乳，結果見表1。

由表1可見，依據初步形態觀察，從開菲爾粒中分離出的酵母菌形態完全不同于鮮牛乳和自然發酵乳。從開菲爾粒中分離出的4種形態酵母菌，在鮮牛乳和自然發酵乳中都沒有分離到。而從鮮牛乳和自然發酵乳中分離出的6種形態酵母菌在開菲爾粒中也沒有分離到。說明酵母菌的存在與原料和環境有密切關系。

開菲爾粒本身是發酵劑，經活化后，所含微生物處于活躍狀態，便于酵母菌的分離和篩選。鮮牛乳直接分離和經過自然發酵后分離到形態5，6，7三種形態的酵母菌，僅占總菌數的1.23%～2.70%。調節鮮牛乳的p H值和含糖量，使營養成分和培養條件更適宜酵母菌的生長，分離到形態7的酵母菌，說明該菌在鮮牛乳中基數較少，經過發酵富集后才被分離。從理論上講，滅菌乳在任何條件下都應該分離不到微生物，但事實是自然發酵的滅菌乳樣品中都分離到了各種微生物，特別是經過調整p H值和加糖后自然發酵培養的2號和3號樣所分離到的酵母菌形態類型和數量的確比直接培養分離的1號樣菌數多，形態也更豐富，酵母菌所占比例從0到13.89%。對此可以有2點解釋，一是在銷售環節滅菌乳的貯存條件導致微生物滋生；二是自然發酵過程中，環境微生物的侵入或樣品中極少量微生物因營養和培養條件的改善使菌數和種類增加。

表1 開菲爾粒和自然發酵乳中分離的酵母菌數量統計Tab.1 Separation of the yeast quantity statistics in kefir grains and natural fermented dairy

2.2 酵母菌的形態聚類分析

酵母菌的形態鑒別通常用WL培養基。因為培養基中含有溴甲酚綠指示劑，不同種類的酵母菌在 WL培養基上生長的菌落顏色和形態不同，基于此再結合顯微鏡下酵母菌細胞形態的特點，可以將酵母菌進行初步形態聚類［12］。本研究依據菌落特征和顯微鏡下細胞特征［13］對所分離的130株酵母菌進行了形態聚類，初步分為10種形態類型，形態描述和酵母菌株數見表2。

由表2可看出，酵母菌均以出芽方式繁殖，細胞大小不一。開菲爾粒中含有4種形態的酵母菌，菌落形態不同，但在顯微鏡下觀察細胞形態，形態1，2和4有相似處，均有少量假菌絲形成，與盧鑫研究的一株馬克斯克魯維酵母菌［14］的顯微形態類似，王和平等鑒定的克魯維酵母菌的顯微形態中也有少量假菌絲［15］。初步判定形態1，2和4為馬克斯克魯維酵母。形態1的酵母菌數在開菲爾粒中占有絕對優勢，為優勢菌株。形態5和形態9的酵母菌分別是鮮牛乳自然發酵和滅菌乳自然發酵篩選出的優勢菌株。

2.3 酵母菌的分子鑒定

2.3.1 酵母菌株5.8S r DNA-ITS區RFLP分子鑒定圖譜

在WL培養基初步形態聚類的基礎上，利用5.8S r DNA-ITS區進行RFLP分子鑒定。因為酵母菌的核糖體5.8S r DNA及兩側的轉錄間隔區（ITS）具有顯著的種間差異性［10］，可以作為鑒別酵母菌的分類依據［16］。從10種形態的酵母菌中每個形態隨機各選1株進行5.8S-ITS區基因擴增，PCR擴增產物電泳圖見圖1。

由圖1可以看出，10種形態的酵母菌經PCR產物電泳分析后分成5類，均在450～900 bp之間。其中形態1，2，4，6的PCR條帶一致，均在750 bp；形態3，9和10的PCR條帶一致，均在650 bp；形態5，7，8的條帶各不相同，分別是880，560，450 bp。為了將10種形態酵母菌完全區分開，故將PCR產物用3種限制性內切酶HinfⅠ，HaeⅢ和CofⅠ進行酶切做進一步分析，酶切產物電泳圖見圖2。

表2 開菲爾粒和自然發酵牛乳中酵母菌的形態特征Tab.2 Colony morphology of yeast isolates in kefir grains and natural fermented dairy

由圖2可以看出，經過3種酶切分析后，共得到種6種酶切類型。其中形態3和形態9，10的HinfⅠ和HaeⅢ這兩種內切酶條帶不同。形態1，2，4，6酵母菌的酶切圖譜仍然一致，雖在WL培養基上形態表征不同，但經過5.8S r DNA-ITS區RFLP分析后具有相同的PCR產物及酶切條帶，則初步鑒定其為同一類酵母菌。形態表現的不同是因為菌株所處生長時期和個體差異所致。其余4種不同形態的酵母菌WL培養基聚類分析結果與5.8S rDNAITS區RFLP分析鑒定結果基本一致。

圖1 5.8S r DNA-ITS區PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 PCR amplification pattern of 5.8S rDNA-ITS region of yeast isolates

2.3.2 酵母菌株5.8S r DNA-ITS區PCR擴增產物及酶切產物大小分析

根據酵母菌5.8S r DNA-ITS區PCR擴增產物及3種限制性內切酶酶切產物電泳圖，通過Image Lab軟件進行處理，結合軟件自動讀帶，讀取清晰強度較高的電泳條帶分子量大?。?7］。不同形態類型的酵母菌株5.8S-ITS區域RFLP分析結果及鑒定結果見表3。

本研究對5.8S r DNA-ITS序列分析結果作進一步測序鑒定，即將每一分子類型酵母菌隨機挑選一株，共6株進行測序分析。即將其PCR擴增產物委托上海生工生物工程技術服務有限公司進行基因測序，結果見表4。并將測序序列登陸 GeneBank數據庫（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／Blast.cgi），進行BLAST相似性比對［18］，以相似度大于99%確定其種屬，測序結果見表4。

圖2 酵母菌5.8S r DNA-ITS區擴增產物限制性酶切圖譜Fig.2 Restriction analysis pattern of PCR amplified 5.8S r DNA-ITS region of yeast

表3 5.8S r DNA-ITS區擴增產物大小及酶切片段大小Tab.3 Amplification product size and enzyme fragment size of 5.8S r DNA-ITS region

表4 酵母菌5.8S r DNA-ITS區序列分析結果Tab.4 Sequence analysis results of 5.8S r DNA-ITS region of yeasts

從表4可以看出，經過初步的形態學鑒定和后續的5.8S r DNA-ITS區分子生物學鑒定后，原10種菌落形態酵母菌現分為6種分子類型，歸屬于6個屬的6個種，分別為馬克思克魯維酵母菌（K.marxianus）、隱球酵母菌（Cryptococcussp.）、釀酒酵母菌（S.cerevisiae）、熱帶假絲酵母菌（C.tropicalis）、陸生伊薩酵母菌（I.terricola）和季也蒙畢赤酵母菌（P.guilliermondii）。

開菲爾粒中分離到的4種形態的酵母菌鑒定為2種分子類型。鮮牛乳和自然發酵乳中分離到的6種形態的酵母菌鑒定為5種分子類型。最值得討論的是形態1，2，4和6，它們分別來自于開菲爾粒和鮮牛乳自然發酵，菌落特征和細胞顯微特征完全不同，但是分子類型相同，或許是因為分子鑒定的方法中所涉及到的基因片段相同，它們存在著亞種或菌株水平的區分。

在GenBank數據庫中下載相關菌株序列［19］，利用MEGA4生物學軟件的Neighbor-Joining連接法構建系統發育樹［20］，同時進行1 000次Bootstrap檢驗。系統發育樹上在同一分支的酵母其同源關系最近，同時從聚類結果可以看出各酵母的種屬名稱及各自的分類情況。構建的系統發育樹如圖3所示。

圖3 基于5.8S r DNA-ITS區序列和Neighbor-Joining法構建的系統發育樹Fig.3 Phylo genetic tree based on the 5.8S r DNA-ITS region domain sequences

自然發酵乳和傳統開菲爾粒中以K.marxianus，S.cerevisiae和P.guilliermondii數量最多。其中K.marxianus為重要菌群，占總酵母菌數的38%，在開菲爾粒和自然發酵乳中均分離到，為乳糖發酵型酵母菌［21］，可利用牛乳中的乳糖發酵產生CO2和具有保健功能的脂肪酸等活性物質［22］。尹艷軍從漢森公司提供的開菲爾粒中也分離到了K.marxianus，并比較了其與釀酒酵母的發酵性能［23］，該菌在生長繁殖和代謝過程中，產生促進其他細菌生長的生長素類物質［24］，因而在開菲爾粒中，它不僅促進微生物之間的共生作用而且在提高特殊風味和香氣方面也起到重要作用。S.cerevisiae是非乳糖發酵型酵母，主要源自鮮牛乳自然發酵，占篩選總酵母菌的18%，主要利用葡萄糖發酵產生酒精，并具有很好的耐酒精性。將K.marxianus和S.cerevisiae按比例混合作為發酵低醇度乳酒的發酵劑，不僅酒精含量高而且還具有很好的風味。

3 結 論

本研究從自然發酵乳及內蒙古牧區傳統開菲爾粒中分離純化出130株酵母菌，形態學聚類為10種形態類型，5.8S r DNA-ITS區域PCR擴增產物RFLP分析后得到6種分子類型。經測序、登錄Genbank進行Blast同源性比對鑒定出6種分子類型的酵母菌分別為馬克思克魯維酵母菌（K.marxianus）、隱球酵母菌（Cryptococcussp.）、釀酒酵母菌（S.cerevisiae）、熱帶假絲酵母菌（C.tropicalis）、陸生伊薩酵母菌（I.terricola）和季也蒙畢赤酵母菌（P.guilliermondii）。其中馬克思克魯維酵母菌、釀酒酵母菌和季也蒙畢赤酵母菌為優勢菌群，具有釀造低醇度發酵乳制品的潛力。

本研究將傳統酵母菌形態聚類與分子鑒定相結合，分離篩選出具有發酵低純度乳酒潛質的酵母菌，為進一步進行工業化應用研究奠定基礎，對生產具有不同口感和類型的低醇度發酵乳制品具有重要意義。

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