不同貯藏溫度對小黑麥花粉活力的影響

徐翠蓮 張 丹 田依軒 張俐敏 王瑞清

(塔里木大學植物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

花粉活力是生物學研究的重要內容，其活力大小可估測花粉授精和遺傳后代的能力。一般情況下，植物花粉活力除受本身遺傳特性決定外，還受到保存溫度和相對濕度(花粉相對含水量)等因素的影響。通常，較低的溫度和相對濕度有利于花粉貯藏[1-3]。關于花粉的保存在花卉、果樹上研究較多，而在作物上較少。蓋鈞鎰研究結果表明[4]，在8～12 ℃干燥器中保存9 d的大豆花粉仍有良好的雜交效果，-3 ℃至-4 ℃低溫干燥處理可以保存大豆花粉生活力15 d，比自然條件延長13～14 d。王慶美研究發現[5]，-6 ℃～-10 ℃低溫干燥條件下甘薯花粉的生活力可以保持6 d，其雜交結實率仍達30%左右，可解決親本花期相差1周左右的人工雜交問題。王玉萍對馬鈴薯花粉超低溫保存的研究表明[6]，采用0 ℃、-10 ℃、-20 ℃分別處理12 h的逐步降溫預凍方法可獲得保存后高活力的花粉；冷凍前干燥處理18 h的花粉，保存后的生活力優于干燥處理12 h和24 h的花粉。近年來隨著花粉原生質體分離及遺傳轉化工作的開展，花粉保存有了新的研究與應用價值。

禾本科植物花粉壽命很短，小麥花粉粒在田間放置5 h后授粉結實率降低到6.4%[7]，這對雜交育種及其他研究極為不便。因此，研究花粉的貯藏條件對于延長花粉壽命及開展后續研究工作意義較大。目前關于小黑麥花粉活力的研究未見報道。本研究擬在不同溫度下對小黑麥花粉進行貯藏，研究貯藏條件對小黑麥花粉活力的影響，旨在為小黑麥花粉短期和長期保存提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為春性小黑麥新小黑麥1號、新小黑麥3號、新小黑麥4號和新小黑麥5號(簡稱1、3、4、5號)由石河子大學麥類作物研究所提供。

1.2 試驗方法

田間試驗于2011～2012年在塔里木大學園藝試驗站進行，隨機試驗設計，重復2次，每小區種植10行，行長3 m，行距15 cm，四周設保護行。試驗地肥力中等，試驗田施基肥220 kg/hm2尿素、150 kg/hm2磷酸二銨，拔節期隨水施80 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4，揚花灌漿期施70 kg/hm2尿素、60 kg/hm2KH2PO4。拔節前噴施800 g/hm22,4D-丁酯除草。

揚花期晴天上午十時左右，選取長勢一致、無病蟲害、當天開花散粉的小黑麥麥穗10個，密封好帶回實驗室，減去1/3穎殼，用鑷子撥出花藥，將散出的新鮮花粉裝入1.5 ml凍存管，在室溫、4 ℃、-20 ℃、液氮(-196 ℃)進行貯藏，間隔一段時間用TTC染色法測定花粉活力，每個處理觀察2-3個制片，每片隨機取3個視野，保證每個視野下花粉數目為100個左右。以剛采集的新鮮花粉的活力即初始活力為對照。4 ℃、-20 ℃保存后的花粉需室溫下放置0.5 h后測定活力，而超低溫保存的花粉需要迅速置于自來水下沖洗5～10 min快速化凍，待恢復至室溫后進行測定，記錄不同溫度保存前后花粉的活力，計算花粉活力相對保持率?；ǚ刍盍ο鄬Ρ３致?保存后花粉活力/保存前花粉活力×100%。

1.3 試驗數據的處理與分析

采用SPSS19.0統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗，用Microsoft Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 室溫貯藏對小黑麥花粉活力的影響

圖1 室溫貯藏對小黑麥花粉活力(%)的影響

表1 室溫下小黑麥花粉活力(Y ，%)與時間(x)的擬合方程

將新鮮的小黑麥花粉置于室溫下保存，每隔1h測定活力，結果表明：在室溫條件下兩處理小黑麥花粉的活力均隨著時間延長均呈現急劇下降趨勢(如圖1)。對小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時間(x)進行擬合(如表1所示)。由表1可知， 4個小黑麥品種的花粉活力(Y，%)和保存時間(x)之間均呈極顯著直線負相關關系。由圖1還可以看出，保存3h內小黑麥花粉的活力在80%左右。超過3～4 h，花粉活力降低很快，保存7h后小黑麥花粉活力降至2%～12%，說明室溫條件不適合小黑麥花粉的保存。

2.2 4℃貯藏對小黑麥花粉活力的影響

圖2 4 ℃貯藏對小黑麥花粉活力(%)的影響

表2 4 ℃下小黑麥花粉活力(Y ，%)與保存時間(x)的擬合方程

將新鮮小黑麥花粉裝入凍存管于4 ℃條件下進行保存，每隔4 h測花粉活力。結果顯示：與室溫下保存相比，小黑麥花粉在4 ℃條件下的活力均隨著時間的延長呈現較為緩慢下降趨勢(圖2所示)。對小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時間(x)進行擬合，結果顯示小黑麥品種的花粉活力(Y，%)和保存時間(x)之間呈顯著或極顯著水平的直線負相關關系(如表2)。

由圖2還可以看出，保存8 h后，1號、5號花粉的活力降低到60%左右，3號和4號降低為80%左右。隨著時間延長，花粉活力降低很快，且48 h后花粉活力接近降至0%，且此時不同品種花粉活力存在顯著差異，說明4 ℃低溫貯藏可適當延長花粉活力，可用于小黑麥花粉的短期保存。

2.3 -20℃保存下小黑麥花粉活力研究

圖3 -20 ℃保存對小黑麥的花粉活力(%)的影響

表3 -20 ℃下小黑麥花粉活力(Y ，%)與保存時間(x)的擬合方程

將新鮮小黑麥花粉裝入凍存管，于-20 ℃條件下進行保存，每隔4 h測花粉活力。結果表明，小黑麥花粉的活力均隨著時間的延長也呈現快速下降趨勢(圖3所示)。對小黑麥花粉活力(Y，%)和保存時間(x)進行擬合顯示，Y和x之間呈顯著或極顯著水平的直線負相關關系(見表3)。由圖3可以看出，在-20 ℃保存下1號和5號下降速率快， 16 h后花粉活力接近0%， 3號和4號活力下降趨勢相對緩慢，16 h后花粉活力分別降低為11%和33%，說明不同品種小黑麥花粉耐低溫儲存能力有顯著差異。與4 ℃保存相比，在-20 ℃保存下保存4 h后的花粉活力下降幅度比較顯著，小黑麥1號、5號花粉的活力降低到50%左右，而小黑麥3號和4號降低為65%左右。

2.4 超低溫(-196℃)下花粉活力研究

表4 液氮(-196℃)保存對小黑麥花粉活力(%)的影響

將新鮮花粉在硅膠干燥3 h后投入液氮，保存1 d、5 d和10 d后，在自來水下沖洗化凍，室溫放置0.5 h后測定花粉活力。測定結果(表4)表明，與ck相比，各品種在液氮中保存后的花粉活力降低幅度不大，且保存10 d后花粉活力相對保持率較高，在92%左右，說明液氮超低溫冷凍保存是相對較為理想的保存方式，小黑麥花粉的活力隨著時間的延長不會出現明顯的下降趨勢，理論上可以長時間保存花粉。

3 討論

成熟的花粉具有豐富的貯藏物質，能保證花粉獨立生活所需要的能量和營養供應?；ǚ鄣膲勖芏?，但在低溫環境下細胞內自由水部分被固化，花粉酶促反應減慢，新陳代謝活動得到抑制，衰老過程減慢,可以適當延長其生活力，但由于低溫代謝活動仍繼續進行，花粉生活力最終將會喪失。該研究結果表明：小黑麥花粉的活力在室溫條件下均隨著時間延長呈快速下降趨勢，說明自然條件下小黑麥花粉活力壽命較短；在4 ℃保存下，花粉活力適當延長，保存效果較好；-20 ℃時花粉活力降低很快，花粉壽命較短，不適合保存，是由于花粉細胞內產生冰晶，復蘇后細胞的生活力下降所致。液氮超低溫冷凍保存下的小黑麥花粉的活力隨著時間的延長不會出現明顯的下降趨勢，花粉活力相對穩定。因此小黑麥花粉短期保存可在4 ℃條件下，長期保存可在液氮超低溫下進行。由此可見，超低溫保存是相對較為理想的保存方式，這與前人的結果一致[8-10]，然而關于超低溫保存前后花粉生理生化變化和遺傳性狀穩定性等機理仍有待于進一步研究。

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