化瘀通絡健盤貼的質量標準研究

孟 燦 陳隨清 張培培

（河南中醫學院，河南 鄭州 450046）

化瘀通絡健盤貼的質量標準研究

孟 燦 陳隨清 張培培

（河南中醫學院，河南 鄭州 450046）

目的制定化瘀通絡健盤貼的質量標準。方法采用薄層色譜（TLC）法對處方中乳香、沒藥和血竭進行定性鑒別；采用高效液相色譜（HΡLC）法對血竭中的血竭素進行含量測定。結果薄層色譜專屬性強、斑點清晰、分離度好；血竭素進樣量在0.130～0.455 μg范圍內具有良好線性關系，回歸方程為：Y=5557853187X-49712，r=0.9997；加樣回收率平均值為98.49%，RSD為1.61%（n=6）。結論該方法簡便、檢測靈敏度高、重現性好，可用于化瘀通絡健盤貼的質量控制。

化瘀通絡健盤貼；薄層色譜鑒別；高效液相色譜法；血竭素；質量標準

化瘀通絡健盤貼主要由乳香、沒藥、血竭、青風藤、麻黃、全蟲、細辛、千年健、獨活等13味藥材組成，具有補腎健骨、行氣活血、通絡止痛之功效，臨床用于治療頸、腰椎間盤突出癥等引起的頸、腰以及上下肢疼痛麻木等。為了進一步控制化瘀通絡健盤貼的質量，確保臨床用藥安全有效，本文采用薄層色譜法對處方中血竭、乳香、沒藥3味藥材進行定性鑒別，并以血竭中的血竭素作為定量指標，采用HΡLC法進行含量測定，為有效的控制該貼劑的質量提供科學合理的依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

水浴鍋DK-S26（上海精宏實驗設備有限公司），十萬分之一分析天平BT25S（賽多利思科學儀器），高效液相色譜儀e2695-2998（美國waters公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9053A （上海市醫用恒溫設備廠），高速粉碎機XIA-100A（姜堰市銀河儀器廠），循環水式多用真空泵SHZ-95B（鞏義市予華儀器有限責任公司），自動雙重純水蒸餾器SZ-93（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

血竭素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110811-200704）；化瘀通絡健盤貼及相應陰性樣品均由河南中醫學院第三附屬醫院提供；實驗中所用藥材均于鄭州市張仲景大藥房購買，由河南中醫學院陳隨清教授鑒定全部符合2010版《中國藥典》（一部）相關規定；硅膠GF254（上海亨代勞商貿有限公司），乙腈（色譜純），雙蒸水，其余所用試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 乳香的薄層鑒別：取本品3.0 g，置具塞錐形瓶中，加正己烷10 mL，超聲震蕩15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。按處方配比和制法，制備缺乳香的陰性樣品，按照供試品制備方法制得乳香陰性對照樣品溶液。另取乳香對照藥材0.2 g，置具塞錐形瓶中，加正己烷10 mL，超聲震蕩（功率：250 W，頻率100 kHz）15 min，過濾后濾液作為對照藥材溶液。吸取供試品溶液、陰性對照樣品溶液、對照藥材溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，展開劑為石油醚—乙酸乙酯（5∶1），展開后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液為顯色劑，100 ℃加熱10 min至斑點顯色清晰。最后，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的熒光黃斑點，而陰性對照樣品色譜在與供試品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無對應斑點。見圖1。

圖1 乳香薄層色譜照片及色譜圖

2.1.2 沒藥的薄層鑒別： 取本品6.5 g，置具塞錐形瓶中，加入40 mL乙醇溶解，超聲震蕩（功率：250 W，頻率100 kHz）30 min，過濾后將濾液蒸干，加2 mL乙醇溶解殘渣，作為供試品溶液。按處方配比和制法，制備缺沒藥的陰性對照樣品，同法制備陰性對照樣品溶液。再取沒藥對照藥材0.4 g，置具塞錐形瓶中，按照供試品制備方法制得沒藥對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部附錄ⅥB）[1]試驗，吸取供試品和陰性對照樣品溶液各4 μL以及對照藥材溶液2 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，層析條件為三氯甲烷—乙酸乙酯（80∶1），展開后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液為顯色劑，105 ℃加熱10 min至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點，而陰性對照樣品色譜在與供試品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無對應斑點。見圖2。

2.1.3 血竭的薄層鑒別：取本品2.0 g，加入10 mL乙醚，密塞并振搖10 min，過濾后將濾液作為供試品溶液。按處方配比和制作工藝，制備缺血竭的陰性樣品，按照供試品制備方法制得陰性對照樣品溶液。另取血竭對照藥材0.1 g，同法制得血竭對照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對照品加甲醇制成每1 mL中含血竭素26 μg （血竭素重量等于血竭素高氯酸鹽重量/1.377）的對照品溶液。吸取上述4種溶液各15 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，層析條件為三氯甲烷-甲醇（19∶1），展開后取出，晾干，置日光燈下觀察。結果，在與對照品和對照藥材溶液相對應的位置上，供試品溶液顯相同的橙色斑點，且陰性對照樣品無干擾。見圖3。

圖2 沒藥薄層色譜照片及色譜圖

圖3 血竭薄層色譜照片及色譜圖

2.2 HΡLC法測定血竭素的含量

2.2.1 色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：乙腈—0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液（52∶48）；檢測波長：440 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：38 ℃；進樣量：10 μL，在上述色譜條件下，血竭素與其他成分色譜峰分離度良好，陰性樣品無干擾。理論塔板數按血竭素峰計算不低于4000。結果見圖4。

圖4 化瘀通絡健盤貼中血竭素的HΡLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品適量，除去蓋襯，剪成小塊，取0.15 g，精密稱定，置具塞試管中，精密移取10 mL 3%磷酸甲醇溶液，密塞并振搖3 min，過濾后精密量取續濾液1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，搖勻，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備：精密稱取減壓（五氧化二磷）干燥24 h的血竭素高氯酸鹽對照品1.8 mg，加3%磷酸甲醇溶液定容至10 mL棕色量瓶，搖勻，精密移取1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備[2,3]：按處方的配比和制法，制備缺血竭的陰性對照樣品，精密稱定，照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 線性關系考察：精密吸取血竭素高氯酸鹽對照品溶液（0.026 mg/mL）5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μL進樣，橫坐標：進樣量（x，μg），縱坐標：峰面積積分值，繪制標準曲線得回歸方程為Y=5557853187X-49712（r =0.9997）。結果表明，血竭素進樣量在0.130～0.455 μg范圍內具有良好線性關系，見圖5。

圖5 血竭素標準曲線圖

2.2.6 精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續進樣6次，計算得到血竭素峰面積的RSD為2.38%，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.7 穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別按照“2.2.1”項下條件于0、2、4、6、8、10、14 h進樣測定。結果，RSD為2.74%＜3%，表明供試品溶液在14 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗：取同一批樣品適量，共5份，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣測定。計算其峰面積的RSD=1.36%，表明所建立的方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗：稱取已知血竭素含量的同一批樣品適量，共6份，精密稱定，加入質量濃度為0.026 mg/mL的血竭素高氯酸鹽對照品5 mL，按“2.2.2”項下的方法制備所需供試品溶液，分別按照“2.2.1”項下條件進樣測定，計算加樣回收率。結果求得血竭素平均加樣回收率為98.49%，RSD=1.61%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

2.2.10 樣品含量測定：取5批化瘀通絡健盤貼樣品，分別按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，進樣測定峰面積，用外標一點法計算血竭素含量。結果見表2。

3 討 論

由于該處方有13味藥材組成，藥味較多，采用薄層色譜法對貼劑中各味藥材分別進行了定性鑒別，但因為陰性干擾較為明顯，處理方法相對復雜，所以只對乳香、沒藥、血竭3味藥材進行的薄層色譜鑒別，并且其分離度好、重現性強、陰性無干擾，故采用本文的方法對該方中此3種藥材進行薄層鑒別。

處方中血竭為化瘀通絡健盤貼的君藥，故對血竭中的血竭素進行含量測定。查閱相關文獻發現HΡLC法測定血竭中血竭素的含量通常采用不同比例的乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液為流動相[4,5]，故本試驗對流動相的配比進行了考察，實驗結果表明乙腈—0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液（52∶48）為流動相時，峰分離效果最好，峰面積最大，保留時間最短，且峰形較好。此外，根據藥典對單味藥血竭的檢測，采用440 nm作為檢測波長，結合3D色譜圖，發現在440 nm時，峰分離度好，且峰形對稱，故選其為最佳波長。綜上，本文所建標準能夠有效控制本品質量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010:554-556.

[2] 王杰,吳貴華,呂曙華.HΡLC法測定紅花七厘散中血竭素高氯酸鹽[J].中草藥,2006,37(6):859-860.

[3] 張斌,王麗娜,麻風華,等.高效液相色譜法測定骨復康膠囊中血竭素的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2003,9(3):16-17.

[4] 李長達.安陽固本膏中血竭素的HΡLC含量測定[J].中國現代藥物應用,2012,6(19):119.

[5] 張曉燕,劉敏臣,高菲,等.HΡLC法測定血竭膠囊中血竭素的含量[J].中國醫藥導刊,2009,11(2):297.

Quality Standard Research of Huayu Tongluo Jianpan Stickers

MENG Can, CHEN Sui-qing, ZHANG Pei-pei
(Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

ObjectiveTo formulate Huayu Tongluo Jianpan Stickers to the quality control stan-dards.MethodsTo use thin layer chromatography to identify the Frankincense、Myrrh and Dragon's blood. Use high performance liquid chromatography method for the determination of dr-acorhodin content.ResultsThe TLC is a feasible method with strong specificity, TLC spots were clear and good separation;Dracorhodinin 0.130～0.455 μg has a good linear relationship. The regression equation is Y=6E+09X-49712, r =0.9997. Average sample recovery rate was 98.49%, RSD was 1.61%(n=6).ConclusionThe method is simple, high detection sensitivity,good reproducibility,and can be used for quality control of Huayu Tongluo Jianpan Stickers.

Huayu Tongluo Jianpan Stickers; TLC; HΡLC; Dracorhodin; Quality standard

R284.1

B

1671-8194（2014）10-0008-03

河南省科技創新人才計劃資助項目（編號：114200510014）

*通訊作者:E-mail: suiqingchen@sohu.com