木薯葉致突變作用研究

楊 娟，丁曉雯，*，龍 悅，黃先智

(1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工重點實驗室，重慶400716;2.西南大學蠶學與系統生物研究所，重慶北碚400716)

木薯(Manihot esculenta Crantz)又稱木番薯、樹薯，地下部分結薯。人們種植木薯主要是為了獲取木薯根用來生產淀粉和酒精［1］。大量木薯莖、葉沒能得到充分的利用，尤其是木薯葉，它富含蛋白質、維生素及礦物質，其中蛋白質含量在4.0%～9.6%之間，干葉中為 20.6% ～36.4% 之間［2－3］。因此木薯葉可以養蠶、作為蛋白質補充劑用于禽畜飼料［4－6］。但由于木薯莖葉中含有氰化物，其含量為58.9～162.3mg/kg鮮樣，占全株的2.1%［7］。一定量的氰化物進入人和動物體內，將導致組織細胞窒息，使木薯葉的利用存在一定的安全隱患［8］，相關報道［9－11］顯示，山羊、家兔、耕牛等動物進食過量木薯葉后可發生氫氰酸中毒。由此可見，木薯葉存在著不可忽視的安全隱患，而現國內外對于其安全利用的研究卻微乎其微。僅有報道稱用沸水處理可以降低木薯葉中氰化物的含量［12］。

本實驗室對木薯蠶進行安全性分析時發現蠶蛹具有一定的致突變性，追其原因發現跟木薯葉相關。因此，實驗室對木薯葉進行了安全性分析。在測定木薯葉氰化物含量基礎上，對木薯葉的遺傳毒性進行了研究，以期實驗結果對木薯葉的安全利用提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種清潔級小白鼠，體重18～30g，重慶市中藥研究院動物研究所，許可證號SCXK(渝)2007－0006。

干木薯葉:西南大學蠶學與系統生物研究所提供，產地為廣西南寧。

甲醇(AR)成都科龍化工試劑廠;堿性品紅 溫州市東升化工試劑廠;環磷酰胺(AR)山西普德藥業有限公司;小牛血清 北京燕生政博生物科技有限責任公司;Giemsa染液 上海馨晟試化工科技有限公司;其他常用試劑均為分析純。

XSN－3G顯微鏡 重慶光電儀器有限公司;HH－8數顯恒溫水浴鍋 常州歐化儀器有限公司;KQ5200DB超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;RE52CS－1旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 干木薯葉中氰化物含量的測定 按照參考文獻［13］的方法進行測定。

1.2.2 蠶豆根尖微核試驗 稱取干木薯葉，粉碎加水，分別制成濃度為 1.58、3.16、6.32、15.80、31.59mg/mL 的木薯葉粉溶液，超聲30min(常溫，160W)，過濾，收集濾液備用。

蠶豆根尖微核試驗(micronucleus，MCN)的方法［14］:選擇飽滿、大小均勻的蠶豆種子，置于蒸餾水中浸泡26～30h使其吸脹，于25℃水浴鍋中恒溫培養。用制備好的濾液對蠶豆進行染毒處理，同時做陽性對照(10.0μg/mL環磷酰胺溶液)處理和陰性對照(蒸餾水)處理。各處理組染毒6h之后，每組取發芽種子6～8粒，從根尖頂端切下1cm的幼根用卡諾固定液固定24h，置70%乙醇中，4℃冰箱保存。幼根經過5mol/L鹽酸軟化，席夫氏試劑浸染，二氧化硫洗滌液浸洗，常規制片，顯微鏡觀察。每個處理觀察5個以上根尖，每個根尖至少觀察1000個間期細胞，統計細胞微核數，按下式計算微核率:

微核率(MCN)(‰)=某測試樣品(包括對照組)觀察到的MCN數/某測試樣品(或對照)觀察的細胞數×1000

試驗結果的判定:樣品的微核率與陰性對照的微核率進行比較，如果差異有顯著性并且微核指數在1.5以上，認為樣本具有致植物細胞突變的作用［15］。

1.2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗 采用GB 15193.5－2003《骨髓細胞微核試驗》［16］。

選用健康昆明種小鼠60只，體重25～30g，隨機分成6組，每組10只小鼠，雌雄各半。設一個陰性對照組(蒸餾水)和一個陽性對照組(40mg/kg·bw環磷酰胺溶液)，木薯葉受試物分為四個濃度組，各組均以小鼠最大灌胃體積20mL/kg進行灌胃，兩次灌胃時間間隔為24h。

于第2次灌胃后6h處死動物，取小鼠胸骨，去肉，用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻涂片，自然干燥后放入甲醇中固定5～10min，取出晾干。放入Giemsa應用液中染色10～15min，立即用純水沖洗晾干。先以低倍鏡、高倍鏡粗檢，再用油鏡檢查計數。嗜多染紅細胞(PCE)呈灰藍色，成熟紅細胞(RBC)呈粉紅色，微核呈紫紅色或藍紫色。每張片計數1000個嗜多染紅細胞，并計算含微核的嗜多染紅細胞數，微核率計算公式:

嗜多染紅細胞微核率(‰)=有微核的嗜多染紅細胞總數/嗜多染紅細胞總數×1000

用t檢驗比較各組供試小鼠微核率的差異［17－19］。與陰性對照組相比，若結果為顯著性差異或極顯著性差異，即p＜0.05或p＜0.01，則認為樣本具有致動物體細胞突變的作用;若結果為p＞0.05，則說明樣本不具有致動物體細胞突變的作用。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗 采用GB 15193.7－2003《小鼠精子畸形試驗》［20］。

選用健康昆明種成年雄性小鼠30只，體重25～35g，隨機分成6組，每組5只。設陰性對照組(蒸餾水)和陽性對照組(40mg/kg·bw環磷酰胺溶液)，木薯葉受試物分為四個濃度組。各組均以小鼠最大灌胃體積40mL/kg進行灌胃，兩次灌胃時間間隔為24h。

連續灌胃5次，隨后飼養30d。飼養過程中自由攝食、飲水，于35d頸椎脫臼處死，分別取小鼠兩側附睪，制成精子懸液，常規涂片，甲醇固定，用1%的伊紅染色，于10×40倍顯微鏡下觀察形態。每張片觀察1000個頭、尾完整的精子，記錄畸形精子數，計算精子畸形率，計算公式如下。

試驗結果的判定是以樣品的精子畸變率與陰性對照的精子畸變率進行比較，對比較結果進行統計學分析。如果差異有顯著性，即認為實驗樣品為陽性，可能具有一定的致突變性。

1.2.5 數據統計分析方法 采用SPSS軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 干木薯葉中氰化物的含量

木薯葉中含氰化物使其存在一定的安全隱患。測定結果顯示，實驗用木薯葉中氰化物含量為(5.26±0.59)mg/kg干樣，這與陳建新等［7］測定結果相差較大，原因可能實驗用木薯葉是烘干的，有學者發現烘干可使木薯葉中氰化物的損失率達到50% ～70%［21］。

由此可計算出實驗設計中所取的不同濃度木薯葉中氰化物的含量，如表1～表3所示。

2.2 木薯葉對蠶豆根尖細胞微核率的影響

蠶豆根尖細胞微核試驗與染色體畸變實驗有良好的相關性［22］，蠶豆和動物之間對環境致突變物所引起的染色體畸變等定性反應的一致性可達99%以上［23］，且蠶豆根尖微核試驗快速、簡便、重復性好和靈敏度高，現大量學者將蠶豆根尖微核試驗應用于食品中化學物質致突變性的檢測，作為一種方便快捷的體外試驗方法［24－26］。

表1 木薯葉的蠶豆根尖微核試驗結果Table 1 The results of Cassava leaves of broad bean root tip micronucleus test

表2 木薯葉致小鼠骨髓微核率試驗結果Table 2 The results of mouse bone marrow micronucleus on cassava leaf

木薯葉對蠶豆根尖細胞微核率的影響結果見表1。

從表1可以看出，木薯葉在1.58～31.59mg/mL實驗濃度范圍內，對蠶豆根尖微核率的影響呈現明顯的劑量－效應關系。當木薯葉樣品濃度為15.80、31.59mg/mL(氰化物含量為 83.03 ×10－6、166.05 ×10－6mg/mL)時，與陰性對照比較具有極顯著性差異(p＜0.01)且蠶豆根尖微核指數分別為1.77、2.16。由此判定當木薯葉濃度大于15.80mg/mL以上，對蠶豆根尖細胞可能具有致突變作用。

2.3 木薯葉對小鼠骨髓細胞微核率的影響

小鼠骨髓微核試驗是通過測定骨髓嗜多染紅細胞微核發生率以檢測細胞遺傳損傷的體內微核試驗方法［22］。當紅細胞受到外界誘變因子作用，成熟紅細胞發展為紅細胞時，主核排出，微核仍留在胞漿中。通過小鼠骨髓微核試驗，確認木薯葉是否具有致哺乳動物體細胞突變性。

木薯葉對小鼠骨髓細胞微核率的影響結果見表2。

從表2中可知，陽性對照組中小鼠的骨髓微核率最高，與陰性對照組比較存在極顯著性差異(p＜0.01)，說明在此條件下實驗結果是可靠的。

在雌、雄性小鼠試驗中，木薯葉濃度為15.80和31.59mg/mL時，與陰性對照相比分別存在顯著性差異(p＜0.05)和極顯著性差異(p＜0.01)，而當木薯葉濃度7.90和3.94mg/mL時，與陰性對照均不存在顯著性差異(p＞0.05)。

木薯葉在3.94～31.59mg/mL實驗濃度范圍內，對小鼠骨髓微核率的影響呈現明顯的劑量－效應關系。當木薯葉濃度超過15.80mg/mL以上，即木薯葉中氰化物含量高于83.03×10－6mg/kg時，可能對雌、雄小鼠的體細胞均具有致突變作用。

2.4 木薯葉的小鼠精子畸形試驗

通過觀察精子形態變化來判斷木薯葉對小鼠精子生成、發育的影響，判斷木薯葉對雄性生殖細胞的致突變作用。

木薯葉對小鼠精子畸形影響結果見表3。

如表3所示，陽性對照組對小鼠精子畸變率較陰性對照組存在顯著差異(p＜0.01)，說明在此條件下實驗結果是可靠的。

當木薯葉濃度大于7.90mg/mL，與陰性對照組比均存在極顯著性差異(p＜0.01)。表明木薯葉濃度在7.90mg/mL以上，對小鼠生殖細胞可能具有致突變作用。

表3 木薯葉對小鼠精子畸變發生率的影響Table 3 Effects of cassava leaf on mouse sperm shape abnormality rates

3 結論

由此判定，當木薯葉濃度超過7.90mg/mL(含氰化物濃度41.51×10－6mg/kg)時對小鼠生殖細胞可能具有致突變作用;木薯葉濃度超過15.80mg/mL(含氰化物83.03×10－6mg/kg)時對植物細胞、動物體細胞及動物生殖細胞均可能具有致突變作用。所以，在對木薯葉進行使用的過程中，應注意濃度的限制。另外，雖已證實木薯葉具有致突變作用，且對其有毒物質氰化物進行了測定，但仍不能完全確定其毒性是否與氰化物的含量有關，就木薯葉安全性考量，理應進一步確定木薯葉中氰化物的影響，進一步確定木薯葉致突變性與其氰化物含量之間的關系。

目前，木薯葉作為飼料生產的過程中幾乎未經過任何前處理，安全性極低，這應該引起廣大學者的注意，找出恰當的前處理方法用于木薯葉的開發利用。

國內外學者提出，可利用木薯葉的營養保健功能開發木薯葉營養保健品，將其列為新的食物資源，而開發的過程中遇到諸如口感、安全性方面的問題，有待更多學者致力其中。

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