銀屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17細胞因子mRNA表達水平的測定

韋利強，秦東春，徐武生

1河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院皮膚科 鄭州 450052

銀屑病患者血清IL-26蛋白和全血Th17細胞因子mRNA表達水平的測定

韋利強1)，秦東春2)#，徐武生3)

1河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院檢驗科 鄭州 450052 3)鄭州大學第一附屬醫院皮膚科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1963年12月生，博士，主任技師，研究方向：腫瘤與分子免疫學，E-mail:qindongchun@zzu.edu.cn

IL-26；Th17細胞；皮損面積和嚴重程度指數；銀屑病

銀屑病是一種慢性、反復發作的自身免疫性皮膚病，其確切的病因不明，與基因、激素、環境和感染因素有關。銀屑病病變組織可見大量活化的T細胞、異常增殖的角質形成細胞和浸潤性白細胞[1]。研究[2]發現浸潤的T細胞和角質形成細胞以及其分泌的細胞因子在疾病的發生中扮演重要的角色。在病變皮膚組織中可見大量Th1細胞分泌的細胞因子如TNF-α、IFN-γ和IL-1β，所以一直認為Th1細胞在銀屑病中起主導作用。近年來發現一種新的T細胞亞群Th17細胞，其可合成IL-17和IL-22。IL-17和IL-22可參與銀屑病的發病過程，是銀屑病發生中重要的炎癥細胞因子。除了可以分泌IL-17和IL-22之外，Th17細胞還可合成IL-26[3]。該研究測定銀屑病患者血清IL-26蛋白水平，分析IL-26水平與銀屑病嚴重程度的關系，同時檢測不同類型銀屑病患者全血中Th17細胞因子(IL-17A、IL-22和IL-26)mRNA的表達水平，報道如下。

1 對象與方法

1.1研究對象入選病例為鄭州大學第一附屬醫院2012年12月至2013年5月皮膚科住院部收治的加重期銀屑病患者47例，其中男19例，女28例；尋常型15例，膿皰型12例，紅皮型11例，關節型9例。所有銀屑病患者均由2名以上副主任及以上技術職稱醫師確診?；颊呓?周內未外用糖皮質激素、維生素衍生物、他克莫司等藥物，2周內未行光線療法或光化學療法治療，1個月內未口服維酸類、糖皮質激素及免疫抑制劑等藥物，無系統性紅斑狼瘡等其他免疫性皮膚病及重要臟器器質性病變，采血前檢查血常規、肝功能、腎功能均無異常。健康對照組為鄭州大學第一附屬醫院體檢中心的47例健康體檢者，采集血樣前1個月內無感染情況，既往無銀屑病、血管炎等免疫相關性皮膚病病史。該研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會的審查并獲得批準同意。每位研究對象(包括病例與對照)在正式參加研究前均必須簽署知情同意書，方可為正式研究對象，確保了該研究符合赫爾辛基倫理原則要求。銀屑病組年齡(33.5±16.9)歲，患病時間(4.6±3.6) a，皮損面積和嚴重程度指數(PASI)為(12.12±3.02)。健康對照組年齡、性別與銀屑病組相匹配。

1.2主要試劑和儀器IL-26 ELISA檢測試劑盒(美國BD公司)、RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)、SuperQuickRT MasterMix 反轉錄試劑盒和UltraSYBR Mixture(北京康為世紀公司)、實時熒光定量PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)、酶標儀(美國Bio-RAD公司)、實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)、臺式高速冷凍離心機(美國Heal Force公司)。

1.3 2組血清IL-26蛋白的測定采集靜脈血2 mL，EDTA-K3抗凝，混勻。2組血清IL-26水平用IL-26 ELISA檢測試劑盒測定，嚴格按照說明書進行操作。IL-26 ELISA檢測試劑盒的測定范圍為8～1 000 ng/L。用酶標儀測定A值，測定波長為450 mm。

1.4 2組全血Th17細胞因子mRNA表達水平的測定

1.4.1 總RNA提取 吸取全血100 μL，與RNAiso Plus 200 μL一起置于1.8 mL離心管中，加入氯仿，混勻，室溫靜置5 min， 于4 ℃ 12 000g離心15 min。吸取上清液至另一個1.8 mL離心管中，加入異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min后， 于4 ℃ 12 000g離心10 min。棄去上清，緩慢沿管壁加入體積分數75%乙醇750 μL，于4 ℃ 12 000g離心5 min。棄去所有上清，在超凈工作臺中干燥沉淀5 min。加入無RNA酶的去離子水完全溶解RNA沉淀后，溶解液置于紫外分光光度儀中進行測定，讀取260與280 nm的A值，利用A(260 nm)/A(280 nm)比值估計核酸的純度，A(260 nm)/A(280 nm)比值控制在1.8～2.0。

1.4.2 RNA樣本反轉錄 利用SuperQuickRT MasterMix進行RNA反轉錄。按照試劑盒提供的反應體系進行反轉錄反應。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。-20 ℃保存。

1.4.3 實時熒光定量PCR 利用UltraSYBR Mixture對目的基因進行擴增，總反應體積為50 μL。實時熒光定量PCR引物的正義鏈和反義鏈分別如下。β-actin：5’-TGAGATGGCCTCAGGTGGTA-3’，5’-CGGGCAGGCAGAATAGAGAC-3’；IL-17A：5’-AGAGATATCCCTCTGTGATC-3’，5’-TACCCCAAAGTTATCTCAGG-3’；IL-22，5’-ACAGCAAATCCAGTTCTCCAA-3’，5’-TC CAGAGGAATGTGCAAAAG-3’；IL-26：5’-GGCAGAAATTGAGCCACTGT-3’，5’-TCCAGTTCACTGATGGCTTTG-3’。PCR反應條件：預變性，95 ℃ 10 min；然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，60 ℃延伸1 min，共40個循環；溶解曲線分析，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。以β-actin作為內參，結果以2-ΔCt表示，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參)。

1.5統計學處理采用SPSS 19.0對數據進行分析。所有連續性變量均符合正態分布，方差齊同。銀屑病組和健康對照組之間血清IL-26蛋白水平和IL-17A、L-22、IL-26 mRNA表達水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；銀屑病患者血清IL-26水平與PASI的相關性采用Pearson相關分析；不同類型銀屑病患者間全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1銀屑病組和健康對照組血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA的表達水平與健康對照組比較，銀屑病組血清IL-26蛋白水平升高，差異有統計學意義；同時銀屑病組全血IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表達水平亦升高，差異有統計學意義。見表1。

2.2銀屑病患者血清IL-26蛋白水平與疾病嚴重程度的相關性銀屑病患者血清IL-26蛋白水平與PASI呈正相關(r=0.684,P<0.001)。

2.3不同類型銀屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26mRNA表達水平見表2。不同類型銀屑病患者全血IL-17A和IL-22 mRNA 表達水平差異無統計學意義。但IL-26 mRNA表達水平在不同類型銀屑病患者間差異有統計學意義；且與尋常型、膿皰型和紅皮型患者比較關節型患者IL-26 mRNA表達水平升高，而尋常型、膿皰型、紅皮型患者間差異無統計學意義。

表1 銀屑病組和健康對照組血清IL-26蛋白水平及全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達水平的比較

表2 不同類型銀屑病患者全血IL-17A、IL-22、IL-26 mRNA表達水平

*:與關節型組比較，P<0.05。

3 討論

該研究發現銀屑病患者血清IL-26蛋白水平升高，并與疾病的嚴重程度呈正相關。目前關于IL-26生物學功能的報道不多。Dambacher等[4]報道Crohn病患者血清中IL-26水平升高，并能誘導腸上皮細胞分泌TNF-α和IL-8。最近，Corvaisier等[5]發現IL-26在類風濕性關節炎患者的血清和關節腔積液中均升高，并能促進單個核細胞產生IL-8、TNF-α等細胞因子。IL-26在銀屑病中的作用機制仍然不清楚。IL-26受體(IL-20R1和IL-10R2)表達于皮膚角質形成細胞表面，并能誘導其產生IL-8[6]。這可能是IL-26參與銀屑病發病過程的一種機制。

同時作者分析了不同類型銀屑病患者全血Th17細胞因子mRNA表達情況，發現IL-17A和IL-22 mRNA表達水平在不同類型銀屑病患者間差異無統計學意義，關節型銀屑病患者全血中IL-26 mRNA表達水平高于其他類型銀屑病患者。這可能是由于除了Th17細胞分泌IL-26，關節型銀屑病患者病變關節腔的滑膜細胞也可以分泌IL-26[5]。銀屑病患者病變組織中的IL-17A與IL-22均升高[7]，這與作者發現的銀屑病患者全血中IL-17A、IL-22和IL-26 mRNA表達水平升高是一致的。目前對IL-17和IL-22的生物學功能已有深入研究，但是IL-26的生物學功能仍不清。IL-17又包括IL-17A、IL-17E和IL-17F等，其中以IL-17A為主。IL-17A能激活NF-κB和MAPK信號途徑，引起多種效應，主要效應為誘導中性粒細胞的活化和聚集，同時還能抑制炎癥組織的中性粒細胞凋亡。IL-17A還可以通過刺激血管生成素和基質金屬酶產生，從而促進組織的血管生成和修復。除此之外，IL-17A還能與TNF-α起協同作用，促進IL-6、IL-1β和TNF-α釋放，加劇炎癥進程。但是，IL-17A不能刺激角質形成細胞的增殖[8]。IL-22也是Th17細胞產生的重要炎癥細胞因子。與IL-17A不同，IL-22能促進角質形成細胞的增殖。IL-22能夠刺激角質形成細胞分泌抗微生物氨基酸肽，同時也能促進角質形成細胞分泌基質金屬酶，并且銀屑病病變組織和血漿中IL-22的含量與疾病嚴重程度相關[9]。鑒于IL-22與IL-26擁有一定相似的氨基酸序列，都屬于IL-10細胞因子家族，且二者均可由Th17細胞產生，IL-26是否具有與IL-22相似的生物學功能有待于進一步的研究。

雖然該研究證實了IL-26水平在銀屑病患者中升高，且在關節型銀屑病患者中高于其他類型的銀屑病患者，并與疾病的嚴重程度呈正相關；提示IL-26可成為銀屑病，尤其是關節型銀屑病診斷及治療、監測的輔助指標。但是該研究仍有不足之處，如樣本量偏少，未對IL-26在銀屑病中的發病機制進行深入的研究。所以IL-26要成為關節型銀屑病的臨床輔助診斷指標以及新的治療靶點，仍需要擴大樣本量，同時進行動物實驗研究，以進一步揭示IL-26在銀屑病發病機制中的確切作用。

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(2013-10-11收稿 責任編輯姜春霞)

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.044