胃泌素／CCK2R通過JAK 2／STAT3通路促進胃癌侵襲力轉移的分子機制研究

寇衛政，孫為豪

（1.新鄉醫學院第一附屬醫院腫瘤科，河南新鄉453100；2.南京醫科大學，江蘇南京210029）

胃泌素／CCK2R通過JAK 2／STAT3通路促進胃癌侵襲力轉移的分子機制研究

寇衛政1，孫為豪2

（1.新鄉醫學院第一附屬醫院腫瘤科，河南新鄉453100；2.南京醫科大學，江蘇南京210029）

目的探討胃泌素／CCK2R通過JAK2／STAT3通路促進胃癌侵襲力轉移的分子機制。方法胃泌素和AG490（tyrphostin AG490）干預MKN45胃癌細胞24h，胃癌細胞傷愈實驗和Transwell小室實驗檢測胃泌素對胃癌細胞體外遷移和侵襲的影響，Western blot檢測胃癌細胞中基質金屬蛋白酶2（matrixmetalloprotei-ase-2，MMP-2）、轉錄激活因子3（singnal transducers and activators of transcription3，STST3）和磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3（phosphorylated-singnal transducers and activators of transcription3，P-STAT3）蛋白水平。結果胃泌素組胃癌細胞遷入細胞致傷區的相對距離和遷移侵襲到Transwell小室下部的細胞數分別顯著高于和多于空白對照組（P＜0.05）；AG490組分別顯著低于和少于空白對照組（P＜0.05）；AG490＋胃泌素組分別顯著高于和多于AG490組（P＜0.05）；胃泌素組胃癌細胞中MMP-2和P-STAT3蛋白水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）；AG490組顯著低于空白對照組（P＜0.05）；AG490＋胃泌素組顯著高于AG490組（P＜0.05）。結論胃泌素可以促進胃癌細胞體外遷移和侵襲，并且胃泌素促進胃癌細胞體外遷移和侵襲的可能機制是通過激活JAK2／STAT3信號轉導通路，使MMP-2蛋白和合成量增加，細胞外基質降解，導致胃癌細胞體外遷移和侵襲過程中所受阻力減少。

胃泌素；侵襲；遷移；分子機制；胃癌

胃癌是目前嚴重威脅人類生命健康的一種惡性腫瘤，且病 死率較高，有研究統計表明胃癌是導致患者死亡的第二大惡性腫瘤［1］。目前對胃癌的發病機制研究較多，但還未找到確切的發病機制。近年來研究表明胃癌的發生與胃癌患者體內胃泌素的異常升高有著密切關系［2］。胃泌素是由胃竇部位的G細胞合成分泌的，在正常的環境下胃泌素促進機體胃酸的分泌，但已有臨床研究表明胃泌素的的異常過多表達往往與惡性腫瘤的發生存在十分緊密的關系［3］，已有體外實驗證明胃泌素可以促進多種癌細胞的增殖，侵襲和轉移，如肝癌細胞、胃腸道癌細胞、胰腺癌細胞等等［4-6］。已有研究表明JAK2／STAT3信號轉導通路參與多種腫瘤細胞的侵襲和轉移，在惡性腫瘤的發生與發展過程中起著重要的作用［7］。本文通過胃泌素干擾MKN45胃癌細胞系，觀察相應的指標，探討胃泌素是否通過JAK2／STAT3信號轉導通路促進胃癌細胞侵襲轉移，為胃癌的治療尋找新的治療途徑以及相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 MKN45胃癌細胞系購買自上海研謹生物科技有限公司，五肽胃泌素購自（上海麗珠東風生物技術公司，批號20140202），AG490購自（SIGMA公司，批號S27831），Matrigel基質膠購自（BD公司）；Transwell小室購自（Corning）公司；RIPA裂解緩沖液購自（碧云天生物技術研究所）；P-STAT3、STAT3、MMP-2抗體購自（Bioworlde公司，批號：360703、361001、351034）。垂直電泳槽、Hofer電泳儀購自（Amersham Biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：將所購買的MKN45胃癌細胞在DMEM培養液中培養，培養的條件為：培養液中加入10%小牛血清，37℃，5%CO2濃度，恒溫箱培養，每隔1天更換1次培養液，每培養3天進行細胞傳代1次。用培養細胞的培養液將胃泌素稀釋為45μg／m L，AG490稀釋為50μg／mL。取細胞生長處于對數期的MKN45胃癌細胞，將胃癌細胞分為4組：空白對照組，胃泌素組，AG490組，AG490＋胃泌素組。將胃泌素和AG490分別加入到相應組別的細胞中，干預24 h后進行相應指標的檢測。

1.2.2 MKN45胃癌細胞傷愈實驗：將生長處于對數期的MKN45細胞接種于12孔培養板中，每孔接種的細胞數為4×105個，將接種后的12孔板放入培養箱中培養過夜，培養條件為37℃，5%CO2濃度。過夜后細胞鋪滿12孔板底部，用移液槍頭在12孔板底部相同位置畫一條寬度相同的胃癌細胞刮出帶，然后在空白對照組加入5mL的含有10%小牛血清的DMEM培養液，在胃泌素組加入2.5 mL的胃泌素稀釋液和2.5 mL的含10%小牛血清的DMEM培養液，在AG490組加入2.5 mL的AG490稀釋液和2.5mL的含10%小牛血清的DMEM培養液，在AG490＋胃泌素組加2.5mL的AG490稀釋液和胃泌素稀釋液。將所有孔加入相應的溶液后在培養箱中培養24 h，24 h后在倒置顯微鏡下觀察并測量癌細胞向刮出帶遷移的相對距離，即培養箱0 h的細胞刮出帶的寬度與培養24 h的細胞刮出帶的寬度，本實驗重復3次。

1.2.3 MKN45胃癌細胞Transwell小室實驗：將Matrigel基質膠與不含小牛血清的DMEM培養基預冷，將不含小牛血清的DMEM培養基與溶解為液態的Matrigel基質膠按照1∶5的體積比混溶，在每孔Transwell小室的上部加入上述混合溶液40μL，在37℃的恒溫相中放置5小時，待其凝固，再在凝固的Transwell小室的上部加入70μL的不含小牛血清的DMEM培養基，并在每孔Transwell小室的上部培養基中接種5×104個處于生長對數期的MKN45胃癌細胞，在Transwell小室的下部加入含有30%小牛血清的DMEM培養基500μL。將Transwell小室放置在培養箱中培養24 h，培養箱的條件為：37℃、5%CO2濃度。培養24 h后棄去Transwell小室上部沒有傳入基質膠中的胃癌細胞，10%甲醛固定，時間為20min，吉姆薩紫染色，時間為15min。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，計數胃癌細胞侵襲轉移到Transwell小室下部的個數，本實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測MKN45胃癌細胞中MMP-2、STAT3和P-STAT3的表達：取生長處于對數期的MKN45胃癌細胞接種到培養瓶中，胃泌素和AG490分別加入到相應的組別的培養瓶中，將加入好相應試劑的培養瓶放入到培養箱中進行培養，培養的條件為：37℃、5%CO2濃度，培養干預24 h。收集各組培養干預24 h的胃癌細胞，RIPA細胞裂解液裂解胃癌細胞，提取胃癌細胞中的總蛋白，總蛋白提取液與上樣緩沖液混合沸煮，在聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離蛋白，在轉移緩沖液中將蛋白轉移至NC膜中，5%脫脂奶粉封閉1 h，PBSX洗膜3次，每次10 min，Akt、MMP-2、STAT3和P-STAT3一抗4℃孵育過夜，PBSX洗膜3次，每次10min，二抗常溫孵育2 h，PBSX洗膜3次，每次10 min，在暗室中在目的蛋白的相應位置涂ECL發光試劑，待發光時用膠片曝光，掃描曝光后的膠片，分析各目的蛋白的積分光密度值，并進行統計分析，每組蛋白重復3次。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計學軟件進行實驗數據分析，正態計量數據用“±s”表示，正態資料組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MKN45胃癌細胞傷愈實驗 鋪滿胃癌細胞的12孔板底部畫出細胞刮出帶，用胃泌素和AG490干預24 h后，觀察結果表明空白對照組、胃泌素組、AG490組和AG490＋胃泌素組的細胞刮出帶的寬度均有減小，都有胃癌細胞向致傷區遷移。胃泌素組細胞刮出帶的寬度顯著小于空白對照組（P＜0.05）；AG490組細胞刮出帶的寬度顯著大于空白對照組（P＜0.05）；AG490加胃泌素組細胞刮出帶的寬度顯著小于AG490組，（P＜0.05）。結果提示胃泌素促進胃癌細胞的遷移，JAK2激酶抑制劑AG490抑制胃癌細胞的遷移（見表1、圖1）。

表1 胃泌素與AG490對MKN45胃癌細胞傷愈實驗的影響Tab.1 The impact of gastrin and AG490 on MKN45 gastric cancer cell injury experiments

圖1 胃泌素與AG490對MKN45胃癌細胞傷愈實驗的影響（LM×200）Fig.1 The impact of gastrin and AG490 on MKN45 gastric cancer cell injury experiments（LM×200）

2.2 MKN45胃癌細胞Transwell小室實驗 在Transwell小室的上部接種處于生長對數期的胃癌細胞，在經過胃泌素和AG490干預24 h后，觀察結果表明在空白對照組、胃泌素組、AG490組和AG490＋胃泌素組均有胃癌細胞侵襲到Transwell小室的下部。胃泌素組侵襲到Transwell小室下部的細胞數顯著多于空白對照組（P＜0.05）；AG490組侵襲到Transwell小室下部的細胞數顯著少于空白對照組（P＜0.05）；AG490＋胃泌素組侵襲到Transwell小室下部的細胞數顯著多于AG490組（P＜0.05，見表2，圖2）。

表2 胃泌素與AG490對MKN45胃癌細胞Transwell小室實驗的影響Tab.2 Impact of gastrin and AG490 on gastric cancer cell Transwell chamber experiments

圖2 胃泌素與AG490對MKN45胃癌細胞Transwell小室實驗的影響（吉姆薩染色×200）Fig.2 The impact of gastrin and AG490 for Transwell chamber experiments on MkN45 gastric cancer cell

2.3 MKN45胃癌細胞中MMP-2表達水平的變化 生長處于對數期的MKN45胃癌細胞經過胃泌素和AG490干預24 h后，采用Western blot法檢測胃癌細胞中MMP-2表達水平。檢測結果表明胃泌素組MMP-2表達水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）；AG490組MMP-2表達水平顯著低于空白對照組（P＜0.05）；AG490＋胃泌素組MMP-2的表達水平顯著高于AG490組（P＜0.05，見圖3）。

圖3 MKN45胃癌細胞中MMP-2水平變化1.胃泌素組；2.AG490組；3.AG490＋胃泌素組；4.空白對照組△P＜0.05空白對照組比較；＃P＜0.05與AG490組比較，Fig.3 MMP-2 levels in MKN45 gastric cancer cells1.Gastrin group；2.AG490 group；3.AG490 and gastrin group；4.Control group；compared with control group Each group△P＜0.05；＃P＜0.05 compared with AG490 group

2.4 MKN45胃癌細胞中STAT3和P-STAT3表達水平的變化 生長處于對數期的MKN45胃癌細胞經過胃泌素和AG490干預24 h后，采用Western blot法檢測胃癌細胞中MMP-2表達水平。檢測結果表明STAT3的表達水平在各組胃癌細胞中沒有顯著變化；胃泌素組P-STAT3的表達水平顯著高于空白對照組（P＜0.05）；AG490組P-STAT3的表達水平顯著低于空白對照組（P＜0.05）；AG490加胃泌素組P-STAT3的表達水平顯著高于AG490組（P＜0.05，見圖4）。

圖4 MKN45胃癌細胞中STAT3和P-STAT3水平變化1.胃泌素組；2.AG490組；3.AG490＋胃泌素組；4.空白對照組＃P＜0.05，與空白對照組比較；△P＜0.05，AG490加胃泌素組與AG490組比較Fig.4 STAT3 and P-STAT3 levels in MKN45 gastric cancer cells1.Gastrin group；2.AG490 group；3.AG490 and gastrin group；4.control group；＃P＜0.05，compared with control group；△P＜0.05，AG490 and gastrin group compared with AG490 group

3 討論

胃癌的轉移是一個相當復雜的生物過程，而胃癌細胞的遷移是該過程的起始階段。細胞外基質是阻止胃癌細胞遷移的重要的分子骨架，細胞外基質使胃癌細胞粘附，但體內環境中存在著一些相關因子可以破壞細胞外基質，使細胞外基質降解，使得胃癌細胞的遷移所受到阻力減小。這些相關因子表達水平的異常增多往往導致胃癌細胞的遷移。而胃癌細胞的轉移不但影響著惡性腫瘤的臨床治療效果，也會嚴重的影響惡性腫瘤患者的預，可導致病情的不可控甚至死亡［8］。已有研究表明胃癌的發生發展與胃腸道內的多種激素的異常有關，Takaishi等［9］研究證實胃泌素表達的異常與胃癌的發生發展存在極為緊密的關系，是促進胃癌病情加重的細胞因子。胃泌素的異常合成與分泌往往與胃癌的發生有著極為密切的關系［10-11］。

實驗研究表明胃泌素對MKN45胃癌細胞中MMP-2表達水平的變化，STAT3和P-STAT3表達水平均有統計學意義（P＜0.05）。胃泌素促進胃癌細胞的體外遷移和侵襲可能是由于胃泌素促進MMP-2表達水平的提高，降解細胞外基質，使胃癌細胞遷移和侵襲過程中所遇阻力降低；AG490是JAK2活化的特異性抑制劑，可以特異性的抑制JAK2的活化，進而使得STAT3磷酸為P-STAT3的程度降低，最終使得DNA中表達VEGF、MMP-2的基因表達減少，體內MMP-2的水平減少，細胞外基質的降解程度降低，癌細胞發生遷移和侵襲的能力降低［12］。

綜上所述胃泌素可以促進胃癌細胞體外遷移和侵襲，并且胃泌素促進胃癌細胞體外遷移和侵襲的可能機制是通過胃泌素與細胞膜上的受體結合，然后再通過活化JAK2／STAT3信號轉導通路使得MMP-2蛋白和合成量增加，使得細胞外基質降解，導致胃癌細胞體外遷移和侵襲過程中所受阻力減少。

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（編校：譚玲，王冬梅）

Study on molecular mechanism of gastrin／CCK2R by JAK2／STAT3 pathway promotesmetastasis of gastric cancer invasion force

KOUWei-zheng1，SUNWei-Hao2

（1.Department of Oncology，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453100，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo investigate the gastrin／CCK2R by JAK2／STAT3 pathway promotes invasiveness of themolecularmechanism of gastric cancermetastasis.MethodsGastrin and AG490（Tyrphostin AG490）interfered MKN45 gastric cancer cells 24 hours，cells were recovered from the impact of gastric Transwell chamber experiments and in vitro assay of gastrin gastric cancer cellmigration and invasion，protein levels of gastric cancer cells in Matrixmetallo protei-ase-2（MMP-2），singnal transducers and activators of transcription3（STST3）and phosphorylated-Singnal transducers and activators of transcription3（P-STAT3）were detected by Western blot.ResultsGastrin group moved into cells of gastric cancer cellmigration and invasion to the relative distance and the lower Transwell chamber to cell injury were significantly higher than andmore than the controlgroup（P＜0.05）；AG490 group were significantly lower than and less than the control group（P＜0.05）；AG490 plus gastrin group were significantly higher than and more than AG490 group（P＜0.05）；gastrin group gastric cancer cellMMP-2 and P-STAT3 protein levelswere significantly higher than the controlgroup（P＜0.05）；AG490 group was significantly lower than the control group（P＜0.05）；AG490 plus gastrin group was significantly higher than AG490 group（P＜0.05）.ConclusionGastrin can promote gastric cancer cellmigration and invasion in vitro，and gastrin promote gastric cancer cell invasion in vitro migration and possible mechanism is through the activation of JAK2／STAT3 signal transduction pathways，so that MMP-2 protein and synthesis increase，extracellularmatrix degradation，leading to reduce gastric cancer cellmigration and invasion in vitro process suffered resistance.

gastrin；invasion；migration；molecularmechanisms；gastric

R735.2

A

1005－1678（2014）09－0038－04

國家自然科學基金（81072030）

寇衛政，男，碩士研究生，主治醫師，研究方向：消化道惡性腫瘤綜合治療，E-mail：qch1821460033＠163.com。