杜氏鹽藻過氧化物酶1酵母雙雜交誘餌質粒的構建*

王 靜，龔方華，張彥婷，王瑞莉，薛樂勛 ，關方霞#

1)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001 2)鄭州大學第一附屬醫院細胞生物學研究室 鄭州 450052

過氧化物酶廣泛存在于真核生物中，作為一種抗氧化劑，可以催化H2O2以及脂質氫過氧化物還原，避免細胞受損[1]。過氧化物酶1(peroxiredoxin 1，Prdx1)是過氧化物酶家族中分布最為廣泛的成員之一，廣泛分布于胞質、胞核中，參與細胞內多種生理過程，例如Prdx1對H2O2介導的信號轉導具有調節作用[2]。Prdx1 還存在于鞭毛中[3]，但是其在鞭毛中的功能未知。杜氏鹽藻是一種單細胞真核藻類，可以在極端高鹽的環境下生長，具有等長雙鞭毛，因而非常適合作為研究鞭毛內信號通路的模式生物[4]。該實驗首先構建杜氏鹽藻過氧化物酶1(Dunaliella salina Prdx1，DsPrdx1)酵母雙雜交誘餌質粒pGBKT7-Prdx1，并分別轉化酵母菌株Y187和AH109，檢測其對酵母菌株有無毒性和自激活作用，為篩選DsPrdx1相互作用蛋白、研究其在鞭毛中的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻藻株為UTEX-LB-1644，購自美國得克薩斯州大學，大腸桿菌DH5α和杜氏鹽藻cDNA酵母文庫由作者所在的實驗室保存，酵母菌株Y187和 AH109、載體 pGBKT7購自 Clontech公司，載體pGEM-T購自Promega公司。酵母培養基購自上海 Genomics公司，X-α-gal購自Sigma公司，EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自大連TaKa-Ra公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，PCR特異性引物由Sangon公司合成，紫外分光光度計購自Thermo公司，PCR儀購自Biometra公司，電泳儀購自北京六一實驗儀器廠，凝膠成像儀購自Synoptics公司。

1.2 DsPrdx1開放閱讀框(ORF)的擴增 設計上、下游分別含有EcoRⅠ與BamHⅠ位點的特異性引物[Prdx-ORF上游引物:5'-CCGGAATTCATGCCTG TACCCACGATT-3'(EcoRⅠ)，Prdx-ORF 下游引物:5'-CGCGGATCCTTATGACAGGGTGTTGAAGT-3'(BamHⅠ)]，以杜氏鹽藻cDNA為模板，PCR擴增DsPrdx1(GenBank序列號 KC999111)的 ORF。100 μL PCR反應體系中含 LA Taq酶0.5 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各 1 μL，dNTPs(10 nmol/L)8 μL，10 × LA Buffer 10 μL，模板 cDNA 1 μL，加 ddH2O 至100 μL。反應程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，30個循環;72℃延伸10 min，4℃終止反應。PCR反應結束后，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

1.3 PCR產物克隆和鑒定 PCR產物膠回收后與克隆載體pGEM-T相連，轉化到大腸桿菌DH5α中，將菌液均勻涂布于LB固體培養基上進行藍白斑篩選。挑取白色單克隆于LB液體培養基中，37℃振蕩培養6 h后提取質粒進行酶切鑒定，酶切鑒定正確后測序以分析序列的正確性。

1.4 誘餌質粒pGBKT7-Prdx1的構建 將鑒定正確的pGEM-T-Prdx1質粒與pGBKT7載體用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切，將回收純化的酶切后片段連接并轉化大腸桿菌DH5α，擴大培養并提取質粒pGBKT7-Prdx1，測序。

1.5 誘餌質粒的轉化

1.5.1 制備酵母感受態細胞 挑取酵母菌Y187和AH109的單克隆，接種于5 mL YPDA液體培養基中，30℃恒溫搖床振蕩培養16～20 h(230～250 r/min)至光密度值(OD600nm)為 0.15 ～0.30 后，接種于50 mL YPDA液體培養基中，30℃、250 r/min振蕩培養至OD600nm為0.40～0.50(約3 h)。室溫下將酵母菌菌液以2700 r/min離心5 min。棄上清，加50 mL去離子水重懸沉淀，再次離心棄上清。用3 mL TE/LiAc溶液重懸，將重懸的酵母細胞分裝于1.5 mL 的離心管中，12000 r/min離心30 s，棄上清，加600 μL TE/LiAc重懸細胞，所得細胞懸浮液即為酵母感受態細胞。

1.5.2 誘餌質粒轉化酵母菌 在1.5 mL的離心管中加入 50 μL酵母感受態細胞、0.5 μL誘餌質粒、500 μL PEG/LiAc溶液與5 μL 鯡魚精 DNA，渦旋混勻。將離心管置于30℃水浴鍋中孵育30 min。向離心管中加入 20 μL DMSO，混勻，42℃孵育 20 min，每5 min混勻1次。將混合液2700 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL YPDA液體培養基重懸沉淀，30℃孵育90 s，離心棄上清，用9 g/L的NaCl溶液輕輕重懸沉淀。將菌液均勻涂布于SD/-Trp固體培養基上，30℃倒置培養3～5 d，直至長出單菌落。

1.6 自激活檢測 將轉有誘餌質粒和空載體質粒的Y187和AH109酵母菌分別劃線于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/-His/X-α-gal 以及 SD/-Trp/-Ade/X-α-gal固體培養基上。如果酵母菌株在SD/-Trp/-His/X-α-gal培養基上生長，則在酵母雙雜交篩選過程中需要加入組氨酸抑制劑3-AT以抑制組氨酸泄露。如果菌株在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal培養基上生長，則誘餌蛋白對報告基因有自激活作用，不適合用酵母雙雜交的方法篩選相互作用蛋白。

1.7 毒性檢驗 將含有誘餌質粒的 Y187和AH109酵母菌菌株分別劃線于SD/-Trp固體培養基上，30℃倒置培養，挑取大小相近的克隆分別接種于SD/-Trp液體培養基中，30℃，250 r/min振蕩培養20 h，測 OD600nm。若含有誘餌質粒的菌株OD600nm低于0.80，則說明誘餌蛋白的存在阻礙了酵母菌株的生長，該蛋白不適合用酵母雙雜交的方法篩選相互作用蛋白。

2 結果

2.1 DsPrdx1基因的克隆及鑒定 PCR擴增所得片段長度約為600 bp(圖1)。提取質粒pGEM-TPrdx1經雙酶切后電泳顯示為兩條帶，一條約為3000 bp，為線性pGEM-T載體;另一條約為600 bp，為插入片段DsPrdx1(圖2)，測序后發現DsPrdx1無堿基突變和移碼突變，可用于構建酵母雙雜交誘餌質粒。

2.2 誘餌質粒的構建及雙酶切鑒定 將pGBKT7-Prdx1轉化到大腸桿菌DH5α中并提取質粒進行雙酶切鑒定，電泳后顯示為兩條帶，一條約為7300 bp，為線性pGBKT7載體;另一條約為600 bp，為插入的DsPrdx1 cDNA片段(圖3)，對誘餌質粒進行測序表明DsPrdx1沒有發生突變，誘餌質粒構建成功。

圖1 DsPrdx1 PCR擴增產物

圖2 pGEMT-T-Prdx1雙酶切結果

圖3 誘餌質粒雙酶切結果

2.3 誘餌質粒pGBKT7-Prdx1的轉化 轉化pGBKT7-Prdx1的酵母細胞 Y187和 AH109的菌落PCR鑒定結果見圖4。

2.4 誘餌質粒的自激活作用檢測 見表1。

2.5 誘餌蛋白的毒性檢測 將轉化有誘餌質粒的Y187和AH109酵母菌接種于SD/-Trp液體培養基，30℃恒溫搖床振蕩培養20 h后測得OD600nm分別為1.199 和1.233，均大于0.80，表明誘餌蛋白對酵母菌Y187和AH109無毒性。

圖4 誘餌質粒轉化酵母菌菌落PCR鑒定

表1 誘餌載體的自激活作用檢測

3 討論

ROS(reactive oxygen species)過量積累會對細胞產生損傷[5]。Prdx1作為生物體內廣泛存在的一種抗過氧化物酶，可以有效清除生物體內產生的過量ROS;此外，Prdx1還具有信號傳導、分子伴侶等功能，并且參與了多種氧化相關的病理與生理過程[6-7]。有研究[3]表明 Prdx1存在于精細胞的尾部即鞭毛區域，但其在鞭毛中的功能尚不清楚。真核生物的鞭毛是一種細胞表面突起的亞細胞結構，主要由細胞微管組成[8]，在細胞信號轉導、個體發育等過程中具有重要作用。鞭毛的組裝與去組裝過程伴隨細胞周期的進行呈周期性動態，但是其生長調控機制尚不明確。杜氏鹽藻是一種單細胞真核藻類，具有等長雙鞭毛，因而非常適合作為研究鞭毛內信號通路的模式生物。因此，用DsPrdx1作為誘餌釣取其相互作用蛋白的方法為進一步研究Prdx1在鞭毛中的功能提供了可能。

酵母雙雜交技術是一種直接在真核活細胞內檢測蛋白相互作用的方法[9]。酵母雙雜交系統不僅可以研究已知蛋白之間的相互作用，還可以發現與已知蛋白相互作用的未知蛋白。該實驗構建了融合有DsPrdx1基因片段的誘餌質粒pGBKT7-Prdx1，并將誘餌質粒分別轉入酵母菌Y187和AH109中，通過毒性檢驗證明了誘餌蛋白對酵母菌的生長沒有毒害作用。另外，假陽性的存在是酵母雙雜交的最大缺點，其主要原因是誘餌蛋白對報告基因的激活作用。該實驗觀察了誘餌質粒的自激活作用，結果表明誘餌蛋白對酵母菌AH109與Y187均無自激活作用，可以用于酵母雙雜交系統。該實驗結果為今后篩選DsPrdx1的相互作用蛋白奠定了基礎。

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