高原習服黃牛腦組織不同部位SLC25A6 mRNA絕對定量分析

王志強+俞紅賢+荊海霞+張勤文+魏青+梁林+牛亮

摘要：為研究SLC25A6 mRNA在高原習服黃牛腦組織中的表達量對能量利用的影響，建立用于SLC25A6基因絕對定量的標準曲線；標準曲線擴增效率為E=104.9%，回歸系數r值為-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一；絕對定量檢測值表明，高原習服黃牛腦組織各部位SLC25A6 mRNA表達量總體差異有統計學意義，SLC25A6 mRNA檢測值從高至低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦SLC25A6基因表達量顯著高于其他各組織；頂葉表達量最低，小腦表達量為頂葉表達量的2.79倍；額葉、顳葉、頂葉之間差異，枕葉、海馬之間差異均無統計學意義。結果表明，高原習服黃牛腦組織中小腦耗能強度可能最大，細胞活動旺盛；相反頂葉耗能強度最低。

關鍵詞：高原習服黃牛；腦組織；線粒體；SLC25A6基因；ANT3；絕對定量

中圖分類號：S852.16+1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0039-03

青藏高原平均海拔在4 500 m左右，大氣壓及氧分壓較低，高寒干燥、紫外輻射強度大，特殊的地理及氣候條件造就了特殊的生態環境；由于獨特的高原環境長期影響，使得土著動物及人類在機體各個方面形成了對高原環境的低氧適應。機體獲取的氧氣最終通過線粒體被利用，糖類、脂肪、氨基酸在細胞質基質中完成糖酵解過程后，通過線粒體的三羧酸循環及氧化磷酸化途徑，利用組織氧生成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），從而為機體提供能量。

動物及人由低海拔地區進入高海拔地區后，機體會通過代償等方式來適應低氧環境，從而減輕缺氧初期出現的癥狀，促使機體產生高原習服。研究表明，哺乳動物中樞神經系統對氧分壓的改變極為敏感，腦組織不同區域會通過分子、細胞等各個水平的改變來適應低氧^[1]。但急性低氧暴露仍會損傷腦組織，造成神經細胞出現散在性壞死等現象^[2]。急性重復性低氧刺激可使腦組織線粒體功能受到抑制，同時提高腦組織ATP相對水平^[3]。低氧預適應能夠減輕腦組織缺血后海馬細胞凋亡數^[4]，提高線粒體的膜電位、減少線粒體活性氧及一氧化氮的產生^[5]，并通過降低線粒體通透性轉變的概率來減少細胞凋亡數^[6]。

研究表明，線粒體內膜上的腺甘酸轉運體（adenine nucleotide translocator，ANT）能夠促進胞質和線粒體之間二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）與ATP的交換，使能量代謝順利進行；而且ANT的4種異構體均與細胞凋亡途徑有關^[7]，由SLC25A6基因編碼的線粒體內膜蛋白ANT3表達量增高可引起線粒體膜通透性的改變，從而誘發細胞凋亡^[8-9]。

應用絕對定量的方法，對高原習服黃牛SLC25A6 mRNA在腦組織不同部位的表達情況進行研究，以期揭示低氧環境對高原習服黃牛腦組織不同部位能量代謝的影響，為哺乳動物低氧適應的分子機制及高原醫學積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 動物來源及樣品處理

于青海省海晏縣（海拔3 000 m左右）選取臨床健康成年高原習服黃牛，頸動脈放血致死后，迅速取大腦額葉、顳葉、頂葉、枕葉、海馬及小腦皮層樣本，將其置于液氮中低溫保存，用于提取總RNA。

1.2 主要儀器與試劑

低溫高速離心機、普通PCR擴增儀、核酸電泳儀、紫外凝膠成像儀、核酸蛋白檢測儀、real-time PCR擴增儀；2×Taq PCR MasterMix（含染料）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、PMD19-T Vector，均購自寶生物工程（大連）有限公司；RNAsimple Total RNA Kti試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司、質粒DNA小量抽提試劑盒、EcoRⅠ，均購自上海生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 設計并合成引物 通過美國國家生物技術信息中心查詢普通牛（Bos taurus）SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），根據其序列利用DNAMAN、Primer5設計特異性引物（表1），預計擴增目的基因片段長度為95 bp。引物設計后交由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2 總RNA的提取及RT-PCR反應 利用RNAsimple Total RNA Kti試劑盒，按照說明書步驟，提取高原習服黃?？俁NA。

1.3.3 絕對定量標準品的制備

1.3.3.1 SLC25A6基因片段擴增 以反轉錄產物為模板進行PCR擴增反應，PCR反應加樣體系如下：模板1 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 10.5 μL，Solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸30 s，30個循環；72 ℃ 4 min充分延伸。產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3.2 克隆SLC25A6基因片段并驗證 利用Solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產物純化，純化產物與PMD19-T Vector在 16 ℃條件下連接1 h。后經42 ℃熱擊及冰浴等反應與E.coil DH5α感受態細胞進行連接，將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素、半乳糖苷酶和異丙基硫代半乳糖苷的LB固體培養基平板上，37 ℃溫箱中培養12 h。挑取白色陽性單菌落，接種于含Amp的LB液體培養基中，振蕩培養12 h。利用通用引物對菌液進行PCR初步鑒定后，對陽性轉化子進行測序以進一步驗證。

1.3.3.3 質粒DNA抽提、酶切及純化 利用質粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進行質粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質粒進行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標DNA條帶進行回收純化，從而去除酶切不完全的環狀質粒。

1.3.3.4 質粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質粒進行濃度測定。根據公式：質?？截悢担截悢?μL）=6.02×1023（拷貝數/mol） ×質粒濃度（g/μL）/質粒分子量（g/mol），得出質?？截悢?，然后將質粒進行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數/μL的7個梯度，作為標準品。

1.3.4 real-time PCR反應 real-time PCR擴增反應的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴增程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉錄產物cDNA上機后進行1個循環，使cDNA由單鏈變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環。待測樣品設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 總RNA檢測結果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結果見表2，各項指標均符合要求。凝膠電泳檢測結果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現象出現。

2.4 高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量

通過反轉錄試劑盒進行反轉錄時，20 μL的反轉錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進行Real-time PCR時，反應體系中加入了2 μL反轉錄產物。根據標準曲線中CT值與基因拷貝數的關系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達量。高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量見表3、圖5。高原習服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達量最高，拷貝數均值為3.683×107拷貝數/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達量最低，小腦表達量為頂葉表達量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；頂葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統計學意義。

度地利用氧，并產生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應能夠使損壞腦細胞的不良因素得到抑制或調整，使腦組織在不良環境下度過危險期^[10]。ANT在能量代謝中發揮著重要作用，本試驗通過測定SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的表達情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習服情況下對能量的利用情況。

由于反轉錄產物cDNA為單鏈，而標準品質粒為雙鏈，所以進行Real-time PCR時，先將cDNA進行1個循環的擴增，使其變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗結果表明，標準曲線的擴增效率為E=104.9%，回歸系數r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數可以看出標準曲線線性關系良好，引物特異性較強。結果能夠真實反映出SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的實際拷貝數。

本研究結果表明，在高原習服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達量為額葉表達量的2.79倍。頂葉消耗能量強度較低，細胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強度較大，細胞能量代謝較強?？梢酝茢囗斎~為低氧環境敏感區域，小腦抗低氧能力較強。

參考文獻：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達與腦損傷[J]. 化學通報，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預處理對缺血腦組織p53表達的影響[J]. 牡丹江醫學院學報，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細胞凋亡中的表達[J]. 胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應時能量代謝的變化[J]. 首都醫科大學學報，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質粒制備絕對定量PCR標準曲線方法的建立[J]. 農業生物技術學報，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 質粒DNA抽提、酶切及純化 利用質粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進行質粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質粒進行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標DNA條帶進行回收純化，從而去除酶切不完全的環狀質粒。

1.3.3.4 質粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質粒進行濃度測定。根據公式：質?？截悢担截悢?μL）=6.02×1023（拷貝數/mol） ×質粒濃度（g/μL）/質粒分子量（g/mol），得出質?？截悢?，然后將質粒進行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數/μL的7個梯度，作為標準品。

1.3.4 real-time PCR反應 real-time PCR擴增反應的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴增程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉錄產物cDNA上機后進行1個循環，使cDNA由單鏈變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環。待測樣品設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 總RNA檢測結果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結果見表2，各項指標均符合要求。凝膠電泳檢測結果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現象出現。

2.4 高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量

通過反轉錄試劑盒進行反轉錄時，20 μL的反轉錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進行Real-time PCR時，反應體系中加入了2 μL反轉錄產物。根據標準曲線中CT值與基因拷貝數的關系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達量。高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量見表3、圖5。高原習服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達量最高，拷貝數均值為3.683×107拷貝數/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達量最低，小腦表達量為頂葉表達量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；頂葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統計學意義。

度地利用氧，并產生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應能夠使損壞腦細胞的不良因素得到抑制或調整，使腦組織在不良環境下度過危險期^[10]。ANT在能量代謝中發揮著重要作用，本試驗通過測定SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的表達情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習服情況下對能量的利用情況。

由于反轉錄產物cDNA為單鏈，而標準品質粒為雙鏈，所以進行Real-time PCR時，先將cDNA進行1個循環的擴增，使其變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗結果表明，標準曲線的擴增效率為E=104.9%，回歸系數r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數可以看出標準曲線線性關系良好，引物特異性較強。結果能夠真實反映出SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的實際拷貝數。

本研究結果表明，在高原習服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達量為額葉表達量的2.79倍。頂葉消耗能量強度較低，細胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強度較大，細胞能量代謝較強?？梢酝茢囗斎~為低氧環境敏感區域，小腦抗低氧能力較強。

參考文獻：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達與腦損傷[J]. 化學通報，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預處理對缺血腦組織p53表達的影響[J]. 牡丹江醫學院學報，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細胞凋亡中的表達[J]. 胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應時能量代謝的變化[J]. 首都醫科大學學報，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質粒制備絕對定量PCR標準曲線方法的建立[J]. 農業生物技術學報，2011，19（6）：1157-1162.

1.3.3.3 質粒DNA抽提、酶切及純化 利用質粒DNA小量抽提試劑盒對鑒定正確的陽性菌液進行質粒提取。通過EcoRⅠ對抽提的質粒進行酶切37 ℃孵育1 h后，65 ℃ 20 min 使酶失活。將酶切好的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并利用solarbio 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標DNA條帶進行回收純化，從而去除酶切不完全的環狀質粒。

1.3.3.4 質粒DNA濃度測定及梯度稀釋 利用核酸蛋白檢測儀對純化后的線性質粒進行濃度測定。根據公式：質?？截悢担截悢?μL）=6.02×1023（拷貝數/mol） ×質粒濃度（g/μL）/質粒分子量（g/mol），得出質?？截悢?，然后將質粒進行10倍梯度稀釋，分別稀釋成1×108～1×102拷貝數/μL的7個梯度，作為標準品。

1.3.4 real-time PCR反應 real-time PCR擴增反應的加樣體系如下：模板2 μL，濃度為10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，ddH2O2 8.5 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。PCR擴增程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s。首先將反轉錄產物cDNA上機后進行1個循環，使cDNA由單鏈變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環。待測樣品設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 總RNA檢測結果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測儀測定RNA純度及濃度，測定結果見表2，各項指標均符合要求。凝膠電泳檢測結果見圖1，泳道自左至右以此為：額葉、顳葉、頂葉、枕葉、小腦及海馬，18S及28S條帶清晰，并無降解現象出現。

2.4 高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量

通過反轉錄試劑盒進行反轉錄時，20 μL的反轉錄體系中共加入了1 μg的總RNA，而進行Real-time PCR時，反應體系中加入了2 μL反轉錄產物。根據標準曲線中CT值與基因拷貝數的關系，換算出SLC25A6基因在總RNA/μg中的絕對表達量。高原習服黃牛腦組織內SLC25A6基因mRNA表達量見表3、圖5。高原習服黃牛腦組織中小腦SLC25A6基因表達量最高，拷貝數均值為3.683×107拷貝數/μg，顯著高于其他各組織；頂葉表達量最低，小腦表達量為頂葉表達量的2.79倍；顳葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；頂葉與枕葉、海馬表達量均值之間有統計學意義；額葉、顳葉、頂葉均值之間差異，枕葉與海馬之間差異均無統計學意義。

度地利用氧，并產生盡可能多的能量；腦組織的缺氧適應能夠使損壞腦細胞的不良因素得到抑制或調整，使腦組織在不良環境下度過危險期^[10]。ANT在能量代謝中發揮著重要作用，本試驗通過測定SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的表達情況，間接反映腦組織不同部位在高原低氧習服情況下對能量的利用情況。

由于反轉錄產物cDNA為單鏈，而標準品質粒為雙鏈，所以進行Real-time PCR時，先將cDNA進行1個循環的擴增，使其變為雙鏈，后與標準品一同進行40個循環，以避免單鏈與雙鏈之間的差異^[11]。試驗結果表明，標準曲線的擴增效率為E=104.9%，回歸系數r=-0.996，斜率為-3.210，溶解曲線峰值單一。從這些參數可以看出標準曲線線性關系良好，引物特異性較強。結果能夠真實反映出SLC25A6基因在高原習服黃牛腦組織中的實際拷貝數。

本研究結果表明，在高原習服黃牛腦組織中SLC25A6基因的表達量從高到低依次為小腦、海馬、枕葉、額葉、顳葉、頂葉，小腦表達量顯著高于其組織，小腦SLC25A6基因表達量為額葉表達量的2.79倍。頂葉消耗能量強度較低，細胞能量代謝較弱，小腦消耗能量強度較大，細胞能量代謝較強?？梢酝茢囗斎~為低氧環境敏感區域，小腦抗低氧能力較強。

參考文獻：

[1]Pea F，Ramirez J M. Hypoxia-induced changes in neuronal network properties[J]. Molecular Neurobiology，2005，32（3）：251-283.

[2]胡定煜，李 浡，戴榮繼，等. 常壓低氧下Wistar大鼠腦組織中HIF-1α表達與腦損傷[J]. 化學通報，2010，73（11）：1030-1034.

[3]謝勝男，李 昕，李堯華，等. 急性重復低氧對小鼠腦組織血氧飽和度、線粒體功能以及ATP水平的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（4）：755-758.

[4]齊 晶，閔連秋.低氧預處理對缺血腦組織p53表達的影響[J]. 牡丹江醫學院學報，2008，29（1）：34-36.

[5]Plotnikov E Y，Kazachenko A V，Vyssokikh M Y，et al. The role of mitochondria in oxidative and nitrosative stress during ischemia/reperfusion in the rat kidney[J]. Kidney International，2007，72（12）：1493-1502.

[6]Hausenloy D J，Yellon D M，Mani-Babu S，et al. Preconditioning protects by inhibiting the mitochondrial permeability transition[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2004，287（2）：841-849.

[7]Gallerne C，Touat Z，Chen Z X，et al. The fourth isoform of the adenine nucleotide translocator inhibits mitochondrial apoptosis in cancer cells[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2010，42（5）：623-629.

[8]蘭春慧，房殿春，樊麗琳，等. 線粒體內膜蛋白ANT在幽門螺桿菌致胃癌細胞凋亡中的表達[J]. 胃腸病學和肝病學雜志，2009，18（2）：100-102.

[9]Zamora M，Granell M，Mampel T，et al. Adenine nucleotide translocase 3（ANT3） overexpression induces apoptosis in cultured cells[J]. FEBS Letters，2004，563（1/2/3）：155-160.

[10]崔秀玉，呂國蔚. 腦缺氧和腦缺氧適應時能量代謝的變化[J]. 首都醫科大學學報，1996，17（2）：153-155.

[11]李 麗，趙成萍，李 宏，等. 質粒制備絕對定量PCR標準曲線方法的建立[J]. 農業生物技術學報，2011，19（6）：1157-1162.