副溶血性弧菌保藏條件研究

楊勝遠+韋錦+李卓文等

摘要：針對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在低溫條件下容易進入不可培養狀態，難以保藏的問題，通過平板菌落計數法對副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏條件進行了探討。結果表明，NaCl對副溶血性弧菌4 ℃保藏有保護作用，其中以45 g/L NaCl保護效果最佳，而且45 g/L NaCl不影響副溶血性弧菌的生長。將副溶血性弧菌細胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培養基培養后直接于4 ℃保藏，保藏90 d，活細胞數僅由109下降到106。

關鍵詞：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；甘油；培養基；NaCl

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4395-04

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽性細菌，廣泛存在于世界各國的沿海地區，隸屬于弧菌科弧菌屬，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位[1，2]。為了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，國內外學者已對副溶血性弧菌的檢測、預測模型及風險評估、群體感應、防控方法、致病機理等領域研究給予了極大關注[3–11]。然而，由于副溶血性弧菌在低溫條件下很容易進入不可培養狀態[12，13]，采用常規的斜面或半固體培養基在4 ℃冰箱保藏的時間很短，通常4 ℃保藏15～30 d已無法通過國家標準GB/T 4789.7–2013的3%氯化鈉堿性蛋白胨水培養基[14]或TCBS瓊脂培養基活化。一些研究或檢驗機構為了保藏副溶血性弧菌標準菌株，常采用室溫保藏或-80 ℃冷凍保藏。

雖然室溫保藏成本低，但是需要經常轉接活化，不斷傳代容易發生菌種變異，難以滿足菌種保藏“在一定時間內使菌種不死、不變、不亂”的基本要求；副溶血性弧菌是病原菌，需要執行雙人雙鎖管理，頻繁的轉接菌種和培養操作，增加了菌種保藏和安全防護的工作量。-80 ℃冷凍保藏可以抑制副溶血性弧菌的代謝，菌種不易發生變異，但是超低溫冰箱價格貴，能耗高，普通實驗室無法滿足保藏條件，而且菌種使用前需解凍，使用不便，反復凍融操作還會導致菌種死亡。普通冰箱價格相對便宜，一般實驗室均具備，因此如能解決副溶血性弧菌在低溫條件下易進入不可培養狀態的問題，實現4 ℃冰箱保藏將對相關的研究和檢驗工作具有極大的推動作用。本研究旨在對副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏條件進行研究，探尋一種方便的副溶血性弧菌短期保藏方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CP1由廣東海洋大學孫力軍教授惠贈。

試劑：TCBS瓊脂培養基，青島海博生物技術有限公司生產；其他試劑均為市售國產生化試劑或分析純試劑。

儀器：LRH-250型恒溫培養箱，上海-恒科學儀器有限公司；HZQ-X100型恒溫雙層振蕩培養箱，太倉市實驗設備廠；VX-200型漩渦混合儀，美國Labnet公司。

培養基：30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水瓊脂培養基（Alkaline Peptone Water Agar， APWA）及30 g/L氯化鈉堿性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water， APW）參照文獻[14]進行配制，其中APWA培養基的瓊脂用量改為10 g/L，APW培養基只對氯化鈉濃度進行相應調整。

1.2 試驗方法

1.2.1 副溶血性弧菌的培養 從副溶血性弧菌斜面挑取1環菌苔接入裝有100 mL 30 g/L NaCl-APW 培養基的250 mL三角瓶，于37 ℃、120 r/min搖床培養12 h，作為種子液和保藏所需的培養液。

1.2.2 副溶血性弧菌計數 取待測樣品1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋渦混勻，記為10-1；取10-1稀釋液1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋渦混勻，記為10-2；如此依次進行10倍梯度稀釋至10-8。分別取適宜稀釋度的稀釋液1 mL于無菌培養皿中，傾注冷卻到50 ℃左右的30 g/L NaCl-APWA培養基15 mL，混勻、靜置凝固，于37 ℃倒置培養18 h，進行菌落計數。每個稀釋度重復3塊平板，取平均值作為該稀釋度的菌落總數。

1.2.3 不同保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響 將副溶血性弧菌培養液分別與無菌水、無菌30 g/L NaCl溶液、無菌40 g/L甘油水溶液、無菌30 g/L NaCl-40 g/L甘油復合溶液按體積比1∶1進行混合，再用漩渦混合儀充分混勻，然后分裝2 mL無菌Eppendorf離心管，加蓋密閉作為保藏管。分為3組，分別置于25、4 、-20 ℃下保藏，定時取樣測定副溶血性弧菌數。

1.2.4 NaCl濃度對副溶血性弧菌保藏的影響 將副溶血性弧菌培養液分別與10、20、30、40、50、60、70 g/L的無菌NaCl溶液按體積比1∶1進行混合并用漩渦混合儀充分混勻，然后分裝2 mL無菌Eppendorf離心管，加蓋密閉作為保藏管，置于4 ℃保藏，定時取樣測定副溶血性弧菌數。均設3個平行試驗。由于原培養基含有30 g/L NaCl，因此混合液的NaCl終濃度理論值分別為20、25、30、35、40、45、50 g/L。

1.2.5 NaCl濃度對副溶血性弧菌生長的影響 分別取5 mL副溶血性弧菌種子液接入含NaCl濃度分別為30、35、40、45、50 g/L的APW培養基，于37 ℃、120 r/min搖床培養24 h，然后測定各培養液副溶血性弧菌數。

1.2.6 副溶血性弧菌4 ℃保藏條件驗證 分別取1 mL副溶血性弧菌種子液接入45 g/L NaCl-APW培養基，于37 ℃、120 r/min搖床培養24 h，然后置于4 ℃冰箱保藏，間隔30 d取樣測定副溶血性弧菌數；從副溶血性弧菌斜面挑取1環菌苔于45 g/L NaCl-APWA斜面，于37 ℃恒溫培養24 h，加入5 mL無菌45 g/L NaCl溶液覆蓋斜面的菌苔，然后置于4 ℃冰箱保藏，間隔30 d搖勻后用接種環隨機沾取菌懸液1環于45 g/L NaCl-APWA斜面和TCBS斜面進行劃線，于37 ℃恒溫培養24 h，定性觀察副溶血性弧菌數生長情況。

2 結果與分析

2.1 保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響

不同保護劑對副溶血性弧菌保藏的影響見圖1。由圖1可知，加無菌水和30 g/L NaCl 25 ℃保藏較4 ℃和-20 ℃保藏殘存的副溶血性弧菌活菌數高，但由于副溶血性弧菌在25 ℃仍處于旺盛的代謝繁殖狀態，在保藏過程中一直處于不斷分裂，傳代次數越多，菌種發生變異的幾率也越大，因此仍以低溫保藏更具價值。圖1顯示，4 ℃和-20 ℃低溫保藏條件下，加無菌水組的細胞存活率非常低，而加30 g/L NaCl組的細胞存活率較高，保藏30 d，殘存活菌數仍可達到107。結果表明，一定濃度的NaCl有利于減緩副溶血性弧菌的冷傷害。

甘油常作為菌種冷凍保藏的冷凍保護劑，添加40 g/L甘油和30 g/L NaCl-40 g/L甘油復合溶液的試驗組結果顯示，甘油對副溶血性弧菌影響很大，25 ℃保藏30 d已檢測不到活菌，雖然4 ℃和-20 ℃保藏30 d仍有副溶血性弧菌存活，但殘存活菌數很低，已由原來的108下降到103。從方便使用和短期保藏的角度考慮，選擇NaCl作為保護劑，對副溶血性弧菌4 ℃保藏條件進行進一步探討。

2.2 NaCl濃度對副溶血性弧菌保藏的影響

由圖2可知，4 ℃保藏條件下，保藏菌液NaCl終濃度對副溶血性弧菌影響較大。當NaCl濃度低于45 g/L，隨著NaCl濃度的增加，副溶血性弧菌的存活細胞數也增加；當NaCl濃度超過45 g/L，副溶血性弧菌的存活細胞數呈下降趨勢。當NaCl終濃度為45 g/L時，保藏效果最佳，保藏30、60、90 d副溶血性弧菌的存活細胞數分別達到107、106和105。因此，選擇保藏菌液的NaCl終濃度為45 g/L較為適宜。

2.3 NaCl濃度對副溶血性弧菌生長的影響

圖2已表明保藏菌液的NaCl終濃度為45 g/L時有利于副溶血性弧菌4 ℃保藏，圖3對不同濃度NaCl對副溶血性弧菌生長的影響進行了探討，結果表明，當APW培養基的NaCl濃度在30～50 g/L范圍內，副溶血性弧菌均生長良好。因此，結合圖2和圖3的結果，選擇45 g/L NaCl-APW作為培養基對副溶性血孤菌進行培養，培養后直接置于4 ℃進行保藏即可。

2.4 副溶血性弧菌4 ℃保藏條件驗證

從圖4可見，采用45 g/L NaCl-APW培養基培養后直接置于4 ℃冰箱進行保藏，保藏90 d，副溶血性弧菌的存活細胞數僅由109下降到106。

采用45 g/L NaCl溶液覆蓋斜面的菌苔，于4 ℃保藏90 d，以接種環沾取菌懸液劃線接種，結果保藏的菌種在TCBS斜面和45 g/L NaCl-APWA斜面上均生長良好。

驗證結果表明，將副溶血性弧菌細胞置于45 g/L NaCl溶液或含45 g/L NaCl的培養基中進行4 ℃保藏，可有效防止低溫對細胞的冷傷害，4 ℃保藏可達90 d。

3 小結與討論

甘油對副溶血性弧菌有副作用，不宜作為副溶血性弧菌的冷凍保藏的保護劑。NaCl對副溶血性弧菌4 ℃保藏有保護作用，其中以45 g/L NaCl保護效果最佳，而且45 g/L NaCl不影響副溶血性弧菌的生長。將副溶血性弧菌細胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的液體培養基培養后直接于4 ℃保藏，可有效防止低溫對細胞的冷傷害，保藏90 d，副溶血性弧菌活菌數僅由初始的109下降至106。副溶血性弧菌4 ℃保藏具體方法可通過2種方式實現：①先以45 g/L NaCl-APWA斜面培養，再以5 mL 45 g/L無菌NaCl溶液覆蓋，然后置于4 ℃保藏；②以45 g/L NaCl-APW液體培養基培養，取出直接4 ℃保藏。其中以②保藏法更為方便。

4 ℃斜面菌種保藏法具有方法簡便、使用方便、條件容易實現等優點，已成為菌種短期保藏常用的方法，然而副溶血性弧菌斜面于4 ℃保藏15～30 d，副溶血性弧菌就因發生菌種死亡或轉變為不可培養狀態而難以再活化，實際工作中往往造成研究中斷或需要反復購買標準菌株，菌種保藏難的這一問題一直困擾著研究和檢驗人員。本研究表明，NaCl濃度對副溶血性弧菌影響較大，以含45 g/L NaCl的液體保藏方式，4 ℃可保藏3個月。該方法簡便，可以通過以45 g/L NaCl-APW液體培養基培養后取出置于4 ℃保藏或以45 g/L無菌NaCl溶液覆蓋副溶血性弧菌斜面后置于4 ℃保藏2種簡便方法實現低溫保藏，該法可供研究和檢驗人員借鑒。

甘油是菌種冷凍保藏的常用冷凍保護劑，已為廣大學者普遍認同，然而本研究發現甘油對副溶血性弧菌的存活影響很大，無論是室溫、4 ℃或-20 ℃保藏條件下，甘油都對副溶血性弧菌的存活均不利，其原因有待進一步研究。

本研究主要從副溶血性弧菌的存活角度進行研究，解決了4 ℃保藏條件下菌種的存活問題，但4 ℃保藏條件是否對副溶血性弧菌的毒力或生化生理性質有影響，尚需進一步研究。

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