Genistein對Aβ所致癡呆大鼠工作記憶的影響及機制探討

原 麗 郭小姝 解 瑞 劉曉杰 李清山 劉 燕 張翠英

1.山西長治醫學院生理教研室，山西長治 046000；2.長治醫學院附屬和平醫院眼科，山西長治 046000

來源于大豆的異黃酮類物質染料木黃酮（Genistein）又稱金雀異黃素，其結構特與相對分子量均與17β-雌二醇（E2）的結構相似，與雌激素受體β 具有較高的親和力，被稱為植物雌激素[1]。因而被認為低劑量的Genistein 可能是雌激素替代治療或預防神經退行性疾病的有效措施。體外研究也發現，低劑量Genistein 可通過激活Akt 誘導Nrf2 活性，從而降低淀粉樣肽誘導的神經元降解，改善Aβ1-40 所致的癡呆模型大鼠的空間學習記憶的損傷[2]。高劑量的Genistein 可以產生神經元細胞毒作用，并導致細胞凋亡[3]；但不同濃度Genistein 對癡呆模型大鼠工作記憶的具體影響如何及其可能的機制還未見報道。β 淀粉樣肽( β-amyloid peptides，Aβ)在腦內沉積是阿爾茨海默?。ˋlzheimer＇s disease，AD）發生發展的重要病理基礎，最終患者出現進行性的學習記憶和認知功能障礙[4]。故該實驗通過側腦室注射Aβ1-40 制備AD 模型大鼠，觀察不同劑量的Genistein 對AD 模型大鼠空間學習記憶和工作記憶的影響，并探討其可能的機制?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及給藥

3月齡的健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(230±30)g50 只，由山西醫科大學動物中心提供。Genistein 和Aβ1-40 試劑均購于美國Sigma 公司產品，Aβ1-40 溶于0.9%的生理鹽水，Genistein溶于0.5%二甲基亞砜(DMSO)，SD 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg)后，固定暴露顱骨，參照腦立體定位圖譜，側腦室給藥；Genistein 灌胃1 次/d，堅持4 周。

1.2 實驗分組

隨機將SD 大鼠分為5 組：0.9%生理鹽水組、0.5% DMSO 溶劑組、25 nmol Aβ1-40 組、2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組、20 mg/kg Genistein+Aβ1-40。

1.3 Y 迷宮測試

Y 迷宮由3 個等長互為120°角的臂組成,隨機定為A、B、C 區。實驗時將大鼠放入1 個臂的末端,讓其自由出入3 個臂,記錄持續8 min，并記錄大鼠進入各區的次序和總次數（N），以連續進入3 個不同的臂為1 次正確交替反應,記錄正確交替反應次數。自發交替反應率(%)=[正確交替反應次數/(N-2)]×100。

1.4 實時熒光定量PCR

行為學實驗結束后，5 組大鼠斷頭處死、取腦，并分離出海馬組織進行超聲勻漿、提取總RNA、逆轉錄為cDNA、然后采用Real time PCR 以GAPDH 為內參檢測海馬組織中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相對表達量。引物設計具體見表1。

表1 PCR 實驗引物設計

1.5 統計方法

統計學分析采用SPSS18.0 軟件進行，所有數據用均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析的Tukey HSD 法進行檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠短期工作記憶能力的比較

該研究的實驗結果顯示（表2），各組大鼠在8 min 的自發交替試驗中進入Y 迷宮3 個臂的總次數之間差異無統計學意義（P>0.01），表明藥物的給予并沒有影響動物的自發活動。但與正常對照組相比較，Aβ1-40 組大鼠自發交替反應率明顯降低（P=0.000 1），0.5%DMSO 溶劑組與對照組差異無統計學意義(P>0.01)；與Aβ1-40 組相比，Genistein 低劑量組（2 mg/kg）大鼠的自發交替反應率顯著增加（P=0.000），高劑量組（20 mg/kg）大鼠的自發交替反應率差異無統計學意義（P>0.01）。

表2 各組大鼠Y 迷宮自發交替實驗[n=10，（±s）]

表2 各組大鼠Y 迷宮自發交替實驗[n=10，（±s）]

注：各組與正常對照組相比，**P<0.01;各組與Aβ1-40 相比，##P<0.01。

組別進臂總次數自發交替反應率(%)P 值（與對照組比較）對照組0.5%DMSO 組25 nmol Aβ1-40 組2.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組20.0 mg/kg Genistein+Aβ1-40 組28.50±3.10 26.70±3.95 86.08±3.45 84.40±2.87-0.789 27.90±4.04（68.96±6.17）**0.000 27.45±3.64 25.89±3.24（85.53±6.83）##67.55±4.78 0.981 0.000 P 值（Aβ1-40 組比較）---0.000 0.780

2.2 各組大鼠海馬組織STAT3 和Caspase-3 mRNA 相對表達量的比較

如圖1A所示，正常對照組中，STAT3 和Caspase-3 的mRNA相對表達量分別是（0.99±0.03）和（1.0±0.02）,0.5%DMSO 組則分別是（0.97±0.05）與（1.01±0.06），兩組之間差異無統計學意義（P>0.01），但與對照組相比，Aβ1-40 組STAT3 mRNA 相對表達量顯著下降（0.79±0.04，P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相對表達量卻明顯升高（1.25±0.06）；圖1B 顯示，給予低劑量Genistein(2 mg/kg)長期處理后，與Aβ1-40 組相比較，STAT3mRNA 的相對表達量升至（0.96±0.03）（P<0.01），Caspase-3 的mRNA 相對表達量降至（1.0±0.05）(P<0.01)，高劑量Genistein(20 mg/kg)長期處理并無顯著改善，STAT3 和Caspase-3 mRNA 的相對表達量分別是（0.70±0.02）和（1.28±0.05）（P>0.01）。

圖1 各組大鼠海馬組織STAT3 和Caspase-3mRNA 相對表達量A：0.5%DMSO 溶劑組和25nmol Aβ1-40 組與對照組中mRNA 相對表達量的比較，**P<0.01 vs 對照組；B：不同劑量Genistein 治療組與Aβ1-40 組中STAT3 和Caspase-3 的mRNA 相對表達量比較，##P<0.01 vs Aβ1-40 組。

3 討論

Genistein 是異黃酮類物質中活性最高的一種，與E2R 結合后表現出雌激素樣作用，但同時也具有抗雌激素樣作用[5]。而該研究結果顯示，長期低劑量Genistein 灌胃后可拮抗Aβ1-40 所產生的神經毒作用，但高劑量的Genistein 并沒有改善Aβ1-40所導致大鼠海馬認知功能障礙。Maryam 等[6]的研究表明Genistein預處理后可以改善Aβ1-40 所誘導大鼠短期的空間辨別記憶障礙。這與該實驗結果非常相似，我們的Y-迷宮自發交替實驗結果提示，長期低劑量的Genistein 治療后可以拮抗Aβ1-40 的神經毒作用，逆轉大鼠工作記憶的損傷，這是對Maryam 等研究的完善與補充，同時該研究還發現，高劑量的Genistein 處理后，與Aβ1-40 組相比較，自發交替實驗百分率并沒有改善，提示，高劑量的Genistein 并不能發揮神經保護效應。體外實驗發現[7-8]，高劑量的Genistein 可以促發原代培養的皮層神經元的凋亡和壞死，從而影響神經元的功能，Choi[3]的在體實驗也表明，雄性SD 大鼠長期攝取高劑量的Genistein 后，腦組織勻漿中乳酸脫氫酶含量明顯升高，誘發細胞毒作用。有報道稱低劑量的Genistein 可以發揮雌激素受體β 激動劑效應，拮抗Aβ 誘導的神經元細胞的死亡，但高濃度的Genistein 可以作為蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)的抑制劑，研究PTK 的信號轉導通路[9]。同時有研究發現，Genistein 作為PTK 抑制劑有效減弱神經保護肽[Gly14]-humanin(HNG)拮抗Aβ31-35 所致大鼠空間學習記憶損傷的保護作用[10]。我們推測低劑量的Genistein 可能表現雌激素樣作用，而高劑量的Genistein 主要行駛PTK 抑制劑的功能來調節PTK的信號轉到作用。

Genistein 不同劑量對抗Aβ1-40 誘導的神經毒性作用中所表現出不同的生物學作用的分子機制依然有待探索，信號轉導和轉錄激活子（Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT3）是STAT 家族成員之一，可以在許多信號轉到通路中發揮作用，負責將細胞外信號最終傳遞至細胞核，通過誘導靶基因轉錄表達來調節細胞的增殖，分化和凋亡從而影響炎癥與腫瘤的形成[11]。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統，在細胞凋亡機制網絡中居中心地位，Caspase-3 作為Caspase 家族成員之一，則是細胞凋亡進程中的執行者，是最主要的終末剪切酶，發揮著不可替代的作用[12]。該研究發現，高劑量的Genistein 組海馬組織中STAT3 的mRNA 相對表達量均明顯降低，Caspase-3 的相對mRNA 的表達量均顯著上升；低劑量的Genistein 處理組有效逆轉Aβ1-40 誘導的海馬組織內STAT3 和Caspase-3 基因表達的改變。綜上所述，我們認為，STAT3/Caspase-3 可能是Aβ1-40 和Genistein 發揮功能的共同靶點，STAT3 mRNA 的上調以及Caspase-3 表達的壓抑是低劑量Genistein 拮抗Aβ1-40 神經毒性作用的分子機制，而高劑量Genistein 卻表現出相反的基因表達調節機制。

該研究通Y 迷宮實驗探討了不同劑量Genistein 對大鼠神經功能的不同影響，并利用real-time PCR 實驗技術進一步明確不同劑量Genistein 在體內可能的分子機制，通過對Genistein 多重功能的實驗研究來補充完善Genistein 生理機制，為臨床的雌激素替代法治療神經退行性疾病如AD 提供可靠的實驗依據。

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