超高效液相色譜 三重四極桿/復合線性離子阱質譜測定水樣中三苯甲烷類及代謝物

周巖+趙永剛+張蓓蓓+章勇+陳國松??

摘 要 建立了固相萃?。⊿PE）/超高效液相色譜 三重四極桿/復合線性離子阱質譜（UPLC MS/MS/MS）同時測定水體中孔雀石綠（MG）、結晶紫（CV）、亮綠（BG）及其代謝產物隱性孔雀石綠（LMG）和隱性結晶紫（LCV）5種三苯甲烷類殘留的方法。100 mL水樣過濾后用對甲苯磺酸溶液調節pH=4， 經MCX陽離子固相萃取柱富集凈化后，采用BEH C18色譜柱，以乙腈 5 mmol/L乙酸銨溶液（含0.02%甲酸）作為流動相進行梯度洗脫，采用“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）正離子模式進行檢測。5種三苯甲烷類物質MG， LCV， BG， LMG和CV在0.02～10 μg/L濃度范圍內線性良好（r>0.998），回收率為70.9%～101%，相對標準偏差（RSD，n=6）為3.4%～11.9%，方法檢出限為0.42～2.2 ng/L，定量限為1.7～8.7 ng/L。本方法快速、靈敏，適用于水體中5種三苯甲烷類殘留物的痕量測定。

關鍵詞 三苯甲烷類； 超高效液相色譜； 三重四極桿/復合線性離子阱質譜； 固相萃??； 水樣

1 引言

孔雀石綠（Malachite green，MG）、結晶紫（Crystal violet，CV）和亮綠（Brilliant green，BG）均為三苯甲烷類染料，因其具有消毒殺菌作用而廣泛用于水產養殖中。 MG和CV在生物體內分別代謝降解產物為隱性孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）和隱性結晶紫（Leucocrystal violet，LCV）。三苯甲烷類及其代謝物具有較高毒性、致癌、致畸、致突變等特性，在生物體內具有較高殘留，對人體危害較大，近年成為水體污染和水產品安全的重點監控污染物[1～3]。美國、加拿大和歐盟等國已將MG、CV列為水產養殖禁用藥，許多國家也制定了相關的法律法規及檢測措施，愛爾蘭規定養殖排放水中MG含量不得超過100 μg/L，飲用水中不得超過1.0 μg/L[4，5]。我國于2002年5月將MG列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動物中；農業行業標準使用準則《無公害食品漁用藥物使用準則》（NY 5071 2002）中也將MG列為禁用藥物；同時嚴禁在水產養殖中使用MG和CV，并規定MG（含LMG）和（含LCV）不得檢出。但由于MG抗菌性效果好，價格低廉，替代品少等原因，仍有少部分養殖用戶違法使用。關于水產品中的三苯甲烷類物質及其代謝物的檢測方法已經建立了相應的國標、行標[6～8]，但目前對水環境中這類殺菌劑并沒有相關控制限值，存在環境監管盲點，安全隱患較大。三苯甲烷類物質分子式見圖1。

目前，三苯甲烷類物質的測定多采用液相色譜法（紫外檢測、熒光檢測）或液相色譜 質譜聯用技術。由于LMG和LCV在紫外可見區無吸收峰，而MG和CV又無熒光響應，故采用高效液相法同時測定這幾類物質時常需要借助一定的前處理手段，過程繁瑣且方法檢出限較高（一般為μg/L級）[9～12]。而采用質譜法[13～16]檢測相對于液相色譜法而言具有更高的靈敏度和更強定性能力。

目前，對三苯甲烷類的殘留檢測文獻多集中在水產品中的研究，而針對水環境中這類物質的研究很少，并且目標化合物的種類也很少[2，11，12，17]，國家尚無相關控制標準。本實驗采用的超高效液相色譜 復合質譜是一種先進的新型質譜儀器，串聯四極桿線性離子阱技術，與普通的液相色譜 三重四極桿串聯相比極大提高了MS/MS掃描能力，縮短分析時間，建立一種簡單、快速、靈敏的方法同時測定水體中5種三苯甲烷類物質， 為進一步分析評價生態環境中污染情況提供可靠的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜ACQUITY UPLC（美國Waters公司）；AB SCIEX QTRAP 5500 質譜儀（美國 AB公司）；固相萃取儀（美國 Supelco公司）；固相萃取柱Oasis MCX 150 mg/6 mL（美國 Waters公司），氮吹濃縮儀（美國 Zymark公司）； 0.22 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜針頭式過濾器（美國 Millipore公司）；Milli Q超純水器（美國 Millipore公司）；渦旋混合器（日本 LMS公司）。

標準品孔雀石綠（MG，純度98.0%）、隱性孔雀石（LMG，純度97.0%）、結晶紫（CV，純度92.5%）、隱性結晶紫（LCV，純度99.0%）、亮綠（BG，純度96.0%）、氘代隱性孔雀石（LMG D6，純度98.5%）、氘代結晶紫（CV D6，純度99.0%）均為德國Dr. Ehrenstorfer公司試劑；氘代孔雀石綠（MG D5，純度99.7%）和氘代隱性結晶紫（LCV D6，純度99.8%）為德國Witega公司試劑。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、異丙醇、乙酸銨（色譜純，德國 Merck試劑）；鹽酸羥胺、對甲苯磺酸（純度99%，瑞士 Adamas公司）；實驗用水Millipore超純水（電阻率：18.2 MΩ cm）。

2.2 溶液配制

1000 mg/L標準儲備液：準確稱?。?0±0.1） mg的MG， LMG， CV， LCV和BG標準品及MG D5， LMG D6， CV D6和LCV D6內標物，用乙腈分別溶解于10 mL容量瓶中，配制1000 mg/L的儲備液。以上標準溶液避光于4 ℃保存，臨用前稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

配置成MG D5 ， LMG D6， CV D6和LCV D6的濃度均為100 μg/L的乙腈溶劑，待用。

2.3 色譜條件

ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱（50 mm ×2.1 mm， 1.7 μm，美國Waters公司）。流動相： 5 mmol/L乙酸銨溶液（0.02%甲酸）（A）和乙腈（B）；采用梯度洗脫模式：0～0.5 min，20% B； 保持；0.5～3.0 min，20%～80% B； 3.0～4.0 min， 80% B；4.0～5.0 min， 20% B。流速0.5 mL/min， 進樣體積5 μL；樣品室溫度8 ℃；柱溫：50 ℃；內標法定量。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描方式，“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）方式。離子化電壓（IS）：5000 V，離子源溫度（TEM）：600 ℃，氣簾氣（CUR）： 276 kPa（40 psi）， 噴霧氣（GS1）：379 kPa（55 psi）， 輔助加熱氣（GS2）： 413 kPa （60 psi）， 碰撞器（CAD）：High。各物質離子對優化后參數見表1。

2.5 樣品處理

分別用5 mL乙腈、5 mL 5%甲酸溶液活化MCX固相萃取柱。量取100 mL水樣，加入2 mL 10%鹽酸羥胺溶液防止待測物降解、1 mL 1.0 mol/L對甲苯磺酸溶液（酸化水樣， 并有利于形成離子對[16]）。搖勻后，以約1 mL/min流速將水樣通過小柱，以富集水樣中的三苯甲烷類化合物。上樣后，依次用3 mL丙酮、5 mL乙腈、5 mL水淋洗小柱除雜，用氮氣吹掃小柱20 min，去除小柱中的水分。最后用10 mL氨水 乙腈（5∶95，V/V）溶液洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于氮吹管中， 用氮吹濃縮儀吹至盡干，用乙腈定容至1.0 mL，加入10 μL 100 μg/L內標混合溶液， 渦旋振蕩混勻，過0.22 μm PVDF濾膜，置于進樣瓶中，待測。3 結果與討論

3.1 質譜條件選擇

采用“桿 阱掃描”（MRM IDA EPI）模式，選擇＼[M+H]+為母離子，再以適當的碰撞能量對MG， LMG， CV， LCV和 BG及其對應同位素內標物進行二級質譜掃描，以響應相對較強的子離子作為定量離子。詳細參數見表1。

三重四極桿/復合線性離子阱質譜，既保留串聯四極桿較好選擇性與靈敏度，也可作為線性離子阱增強二級碎片離子定性功能?！皸U 阱掃描”（MRM IDA EPI）模式，一次進樣可得到用于定量的MRM色譜圖及用于定性的二級質譜圖，與常見的三重四極桿掃描模式相比，增強了二級碎片子離子掃描，極大提高了MS/MS的掃描能力，更有利于增強復雜介質中微量目標化合物的定性能力。圖2以MG為例，比較了EPI掃描模式與MS/MS子離子掃描模式對比， 10 μg/L MG在EPI掃描模式下，碎片離子響應增強近100倍。以MG物質為例，定量離子m/z313.1在MRM分析時進一步得到的子離子掃描的譜圖，如圖3所示。

由于三苯甲烷類化合物屬于極性分子，選用ESI離子源相比于APCI離子源，離子化效率更高。MG， CV和 BG具有銨離子基團，LMG， LCV具有二甲胺基，因此離子化采用正離子ESI源。三苯甲烷類物質二級碎片質譜圖見圖4。

3.2 色譜條件流動相選擇

目標化合物三苯甲烷類物質屬于弱堿性物質，在超高效液相色譜 質譜聯用中，對于正離子電噴霧掃描模式，流動相在弱酸性環境條件下加入適量乙酸銨可以提高待測物離子化效率[18]。當水相中同時添加乙酸銨和甲酸時，有利于目標分析物的分子離子化，目標化合物的色譜峰峰形得到極大改善。本實驗考察了流動相乙腈 5 mmol/L乙酸銨（分別含0.01%，0.02%，0.05%，0.10%和0.20%甲酸）對流動相對目標化合物的影響。隨著H+濃度增加，其對目標分析物的質子化作用增強，分析物在流動相中的電離相應增加，保留能力降低，同時峰形展寬，響應下降。pH值越低，尤其對LCV的峰形影響越大、色譜峰響應減弱、峰形變寬拖尾（圖5中列出流動相不同濃度甲酸對LCV物質的影響）。當甲酸的濃度低于0.02%時，對峰形無影響。根據峰形、響應強度、分離度等因素綜合考慮， 圖5 LCV在不同甲酸濃度下的色譜圖

3.3 內標物的選擇

實驗表明，三苯甲烷類物質對內標物的要求非常嚴格，由于三苯甲烷類物質本身的不穩定及源內裂解等一些特性，選用不同的內標，對各目標物標準曲線的線性影響顯著。在相同的線性范圍下，選擇不同內標物所獲得的線性相關系數見表2。結果表明，選擇與自身結構及性質盡可能相似的內標，可以很好地校正因不穩定和源內裂解產生的誤差問題。內標物的影響在文獻＼[13]中也有提及。

3.4 固相萃取前處理的條件優化

3.4.1 固相萃取柱的選擇 比較了C18、HLB柱和MCX柱對三苯甲烷類物質的萃取效率，結果表明，MCX對三苯甲烷類物質有較好的萃取率，而采用C18、HLB柱進行萃取時，5種物質的回收率較低（10%～50%）。 由于MG， CV， BG屬于堿性離子型化合物，LMG和LCV在酸性溶液中也是離子型化合物， 陽離子交換柱適合堿性離子型化合物的富集與分離，這與實驗結果相吻合。

3.4.2 固相萃取柱的活化溶劑的選擇 三苯甲烷類物質在酸性條件下易形成陽離子。根據陽離子固相萃取柱上樣條件，樣品溶液pH值要小于其pKa兩個單位，保證上樣溶液帶正電荷[2]。

本實驗分別用乙腈、水和乙腈、甲酸 水活化固相萃取柱，進行比較。結果表明，如果選用乙腈、純水活化，對于顯性物質MG， CV， BG回收率約為65%，而隱性物質LMG、LCV回收率則低于50%。而固相萃取柱的活化溶液用酸性溶液酸化后，萃取效率明顯好轉，回收率達到70%以上。所以陽離子交換柱采用酸性溶液活化，上樣水樣調節為酸性，有利于陽離子交換柱對目標化合物的富集。

三苯甲烷類物質極性較大，水樣用離子對試劑對甲苯磺酸酸化，有利于三苯甲烷類物質形成離子對，增加提取效率。同時MG、LMG、CV、LCV、BG對光、熱、氧氣敏感，易甲基化、氧化，所以，在樣品提取時加入還原劑鹽酸羥胺[16]，有利于防止待測物的降解。

3.4.3 洗脫溶劑的優化 為中和分析物的電荷，陽離子交換柱的洗脫溶液pH值要大于其pKa兩個單位，所以洗脫溶劑采用堿性溶液洗脫。在文獻＼[15，16]基礎上，比較了氨水 乙腈（5∶95，V/V）、氨水 甲醇（5∶95，V/V）、氨水 甲醇 乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）3種洗脫液的洗脫效果（見圖7）。氨水 乙腈（5∶95，V/V）回收率很好；氨水 甲醇（5∶95，V/V）對大部分物質回收率低于40%；氨水 甲醇 乙酸乙酯（5∶45∶50，V/V）對BG損失較大，回收率僅30%。最終洗脫溶劑選擇氨水 乙腈（5∶95，V/V）。

3.5 方法的分析性能

3.5.1 標準曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標準曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質量濃度在線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質的線性關系及相關系數。

根據國家環境標準[20]空白實驗未檢出目標物質的檢出限測定方法，本實驗測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經全過程分析，計算其濃度的標準偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標水樣進行回收率測定，每個加標水樣平行配制6份樣品，其加標回收率及精密度結果見表4。

3.6 實際樣品的分析

應用本方法對南京地區、常州地區、蘇州地區、無錫地區及太湖流域等不同來源80個點位的地表水、廢水環境水樣進行分析測定。結果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結果表明，在環境水域中已存在三苯甲烷類物質不同程度的污染。

結果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準確、重現性好的特點，適合水質監測應用，且雜質干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復雜水樣的分析。

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環境監測分析方法標準制修訂技術導則. 中華人民共和國國家環境保護標準.HJ 168 2010

3.5 方法的分析性能

3.5.1 標準曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標準曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質量濃度在線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質的線性關系及相關系數。

根據國家環境標準[20]空白實驗未檢出目標物質的檢出限測定方法，本實驗測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經全過程分析，計算其濃度的標準偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標水樣進行回收率測定，每個加標水樣平行配制6份樣品，其加標回收率及精密度結果見表4。

3.6 實際樣品的分析

應用本方法對南京地區、常州地區、蘇州地區、無錫地區及太湖流域等不同來源80個點位的地表水、廢水環境水樣進行分析測定。結果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結果表明，在環境水域中已存在三苯甲烷類物質不同程度的污染。

結果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準確、重現性好的特點，適合水質監測應用，且雜質干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復雜水樣的分析。

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環境監測分析方法標準制修訂技術導則. 中華人民共和國國家環境保護標準.HJ 168 2010

3.5 方法的分析性能

3.5.1 標準曲線和檢出限 以各組分的峰面積（y）對濃度（x， μg/L）繪制標準曲線，MG， LCV， BG，LMG和CV線性范圍為0.02～10.0 μg/L，質量濃度在線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r>0.998。表3列出三苯甲烷類物質的線性關系及相關系數。

根據國家環境標準[20]空白實驗未檢出目標物質的檢出限測定方法，本實驗測定5.0 ng/L 水樣，配制7份平行水樣，水樣體積為100 mL。經全過程分析，計算其濃度的標準偏差s。以3.14 s為檢出限（LOD），4倍檢出限為定量下限（LOQ），5種物質的檢出限為0.32～2.18 ng/L（表3），方法具有較高的靈敏度，完全滿足水體中三苯甲烷類的分析測定。

3.5.2 精密度與回收率 方法采用空白水樣加標方式，在濃度水平分別為0.5， 1.0和2.0 μg/L的空白加標水樣進行回收率測定，每個加標水樣平行配制6份樣品，其加標回收率及精密度結果見表4。

3.6 實際樣品的分析

應用本方法對南京地區、常州地區、蘇州地區、無錫地區及太湖流域等不同來源80個點位的地表水、廢水環境水樣進行分析測定。結果表明，各水域在一定程度上檢出，濃度在ng/L水平。其中物質濃度最高的是靠近某化工廠池塘水樣MG的濃度為3.64 ng/L，某化工廠長江廢水排出口CV的濃度為12.5 ng/L。結果表明，在環境水域中已存在三苯甲烷類物質不同程度的污染。

結果表明， 本方法具有操作簡便，靈敏度高、準確、重現性好的特點，適合水質監測應用，且雜質干擾少，定性和定量分析更加精確可靠，適合大批量復雜水樣的分析。

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