細胞骨架觀察實驗的改進

王宏剛，陳成彬，王春國，陳 力，宋文芹，白艷玲，張金紅，劉 方

（南開大學 生物實驗教學中心，天津 300071）

細胞骨架是指存在于真核細胞中的蛋白纖維網絡結構，主要包括微管、微絲以及中間纖維三類蛋白［1］。細胞骨架不僅在維持細胞形態，承受外力、保持細胞內部結構的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動［2－3］。細胞骨架的重要作用使其已經成為細胞生物學乃至生命科學、醫學等諸多領域的研究熱點，也成為生命科學類專業學生所必須掌握的重要知識點。多年來，為了讓學生更好地掌握細胞骨架的相關知識及對細胞骨架進行研究的方法，各個高校都付出了艱辛的努力，進行了大量的探索［4］。

目前，在本科生的基礎實驗教學中，細胞骨架的觀察經常采用的是考馬斯亮藍染色法，該方法多采用植物細胞作為實驗材料，取材方便，操作簡單，但也存在諸多缺陷。首先，考馬斯亮藍并不是細胞骨架蛋白的特異性染色劑，而是利用Triton X－100處理細胞后可以保留細胞骨架蛋白而去除其他蛋白的特性來對細胞骨架蛋白進行染色。因此，考馬斯亮藍染色法不能夠對特異性地區分細胞骨架的具體組分。其次，Triton X－100處理后如有其他蛋白質殘留就會對實驗結果造成影響。因此，我們決定對其進行改進，采用間接免疫熒光法特異地顯示微管，采用甲基羅丹明－鬼筆環肽熒光標記法特異地顯示微絲，并針對學生基礎實驗教學的特點設計了教學方案［5－7］。

1 實驗材料和試劑

材料：倉鼠卵巢CHO細胞（以下簡稱CHO）系、人胚腎T細胞293T細胞（以下得稱293T）系、人宮頸癌細胞HeLa細胞（以下簡稱HeLa）系。

試劑：1640培養基、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、雙抗、PBS緩沖液（以下簡稱PBS）、2%BSA （PBS緩沖液配制）、4%多聚甲醛、甲醇、0.1%TritonX－100（PBS緩沖液配制）、小鼠抗人tubulin的單克隆抗體、FITC標記的山羊抗小鼠的熒光二抗、甲基羅丹明－鬼筆環肽、防熒光淬滅封片劑（含DAPI）。

2 實驗方法

2.1 間接免疫熒光標記法顯示微管

在3.5cm培養皿中放入無菌的蓋玻片，加入細胞（本文為CHO）培養至融合度為80%；吸去培養基，加入37℃預溫的PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，加入預冷的甲醇固定15min；吸去甲醇，PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，用濾紙輕輕吸去片子上的液體，滴加20μL、2%BSA封閉液，蓋上培養皿蓋，室溫下封閉15min；吸去封閉液，滴加20μL、1∶200稀釋的小鼠抗人tubulin的單克隆抗體，蓋上封口膜和培養皿蓋，37℃孵育20min；用PBS洗滌3次，每次5 min；用濾紙小心吸去片子上的液體，滴加20μL、1∶500稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗，蓋上封口膜和培養皿蓋，37℃孵育20min；PBS洗滌3次，每次5min；孵育結束后用蒸餾水洗滌片刻，將蓋片風干；在干凈載玻片上滴加3μL含有DAPI的防熒光淬滅劑，將長有細胞的蓋玻片從培養皿中取出，反扣于淬滅劑上；使用熒光顯微鏡觀察，并用冷CCD拍照。

2.2 鬼筆環肽熒光標記法顯示微絲

細胞（293T和HeLa）培養方法同2.1節，當細胞融合度為80%時加入37℃預溫的PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，加入4%多聚甲醛溶液固定15 min；吸去多聚甲醛，加入用37℃預溫的0.1%TritonX－100處理5min；PBS洗滌3次，每次5min；吸去PBS，用濾紙輕輕吸去片子上的液體，滴加20μL、2%BSA封閉液，蓋上蓋，室溫下封閉15min；吸去封閉液，PBS洗滌3次，每次5min；滴加10μL、1∶30稀釋的甲基羅丹明－鬼筆環肽，蓋上封口膜，放入濕盒中，室溫染色15min；PBS洗滌3次，每次5min；用蒸餾水沖洗片刻，在潔凈載玻片上滴加3μL含有DAPI的防熒光淬滅劑，將蓋玻片從培養皿中取出，反扣于淬滅劑上；在熒光顯微鏡下觀察，并用冷CCD拍照。

3 實驗結果

3.1 間接免疫熒光標記法顯示微管

在熒光顯微鏡下，DAPI染色后CHO細胞核經紫外線激發而發出藍色熒光，FITC標記的微管經藍光激發后發出綠色熒光，見圖1和圖2。

圖1 CHO細胞中的微管（100×，示間期）

圖2 CHO細胞中的微管（100×，示有絲分裂后期）

3.2 甲基羅丹明－鬼筆環肽熒光標記法顯示微絲

在熒光顯微鏡下，DAPI染色后的293T和HeLa細胞核經紫外線激發發出藍色熒光，甲基羅丹明－鬼筆環肽標記的微絲經綠光激發后發出紅色熒光，見圖3和圖4。

圖3 293T細胞中的微絲（100×）

4 討論

4.1 實驗材料的選擇

圖4 HeLa細胞中的微絲（100×）

該實驗中，在選擇細胞時應考慮：（1）應盡量選用貼壁生長的細胞株系，這樣可以簡化實驗步驟，節省實驗所需的時間；（2）應盡量選用貼壁牢固的細胞株系，以防學生在操作時應動作不夠輕柔而造成細胞的丟失；（3）應盡量選用體積較大、鋪展較好的細胞株系，以便在觀察時得到較好的效果。

4.2 教學的組織

本科生基礎實驗課最大的特點是課時相對固定，要求學生在一次實驗課（約4～5學時）中完成一個相對完整的實驗內容。我們通過大量的預實驗，對細胞固定的時間、抗體孵育的時間、PBS洗滌的時間及次數等實驗環節進行了優化，以保證大部分學生可以在約3個半小時內完成整個實驗。在教學實踐中，也可以根據自身的實際情況對這些環節進行優化，以保證在不影響授課效果的前提下用合適的時間來完成實驗教學。實驗內容方面也可以根據實際情況進行調整。例如只安排微管與微絲中一種細胞骨架組分的觀察就可以保證學生在較短的時間內在視覺上對細胞骨架形成有一定程度的認識。

5 結束語

基礎實驗教學是生命科學類專業本科生培養過程中最重要的環節之一。在基礎實驗教學的過程中，不但要讓學生通過親自動手操作來進一步掌握在理論課上學到的基礎知識，更要訓練學生的基本實驗技能與操作，提高學生的動手能力和思維能力［8－10］。細胞骨架的觀察是一個很經典、很重要的實驗。這次探索希望能提高學生的學習興趣，幫助其加深對細胞骨架組分中微管、微絲的認識。更重要的是，能幫助學生掌握間接免疫熒光和熒光標記染色的實驗方法，提高學生的科研能力，為學生將來的發展奠定扎實的基礎［11－13］。

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