辛夷6種溶劑順序提取物對黃瓜灰霉病菌的抑制作用

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摘要：采用順序提取法，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水6種溶劑對辛夷進行提取。結果表明：去離子水的提取率最大，為12.06%；石油醚次之，為9.63%。采用生長速率法和孢子萌發法分別測定了辛夷6種順序提取物對黃瓜灰霉病致病菌的菌絲生長和孢子萌發的抑制效果。結果表明：辛夷6種順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發均有抑制作用，且對菌絲生長的EC50基本小于1 000 mg/L，對孢子萌發的EC50均在1 300 mg/L以上，說明辛夷各溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果均優于孢子萌發；石油醚、氯仿和去離子水提取物對菌絲生長和孢子萌發的EC50分別為372.15 mg/L和1 318.92 mg/L，229.84 mg/L和1965.50 mg/L以及845.44 mg/L和4 321.80 mg/L。

關鍵詞：辛夷；順序提取物；灰葡萄孢菌；抑制作用

中圖分類號：X 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2014）09-0009-04

植物是生物活性化合物的天然寶庫，研究和開發植物源農藥是一條研發新農藥的有效途徑。植物源農藥具有易降解、低毒性、對環境污染小等特點，符合當今社會的發展趨勢，已成為研究的熱點。辛夷是我國一種傳統中藥，是望春玉蘭花蕾的統稱[1]。辛夷提取物具有抑菌活性，起抑菌作用的主要活性成分存在于其揮發油中[2-4]。以不同溶劑的辛夷提取物為材料，研究其對黃瓜灰霉病致病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）的菌絲生長和孢子萌發的抑制作用，為辛夷作為植物源農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 辛夷提取物的制備

采用索氏提取法[5-6]，選取極性不同的溶劑（石油醚<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<水），按照溶劑極性由小到大的順序，對辛夷依次進行提取。然后，將提取液旋轉蒸發濃縮，得到黏稠膏狀粗提物，稱定質量并計算其提取率。此后，置于4 ℃冰箱保存。提取率計算公式為：

提取率（%）=×100% （1）

無菌條件下，用微量二甲基亞砜（不超過總體積2%）分別將6種不同溶劑的提取物充分溶解，再用無菌水配制成40 000 mg/L的母液。此后，采用二倍稀釋法將母液配成40 000、20 000、10 000、5 000、2 500 mg/L等5個濃度梯度。

1.2 供試菌株

灰葡萄孢菌從感染灰霉病的黃瓜上分離、純化獲得，保存于聊城大學農學院植物病理學實驗室。

1.3 離體生物測定

1.3.1 生長速率法 采用生長速率法[7]測定辛夷的6種溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果。培養基為含藥PDA（葡萄糖-馬鈴薯-瓊脂培養基），空白對照不加藥；提取物終濃度分別為4 000、2 000、1 000、500、250 mg/L；菌餅直徑為0.5 cm；十字交叉法測量菌落直徑，3次重復。根據菌落直徑計算菌絲生長抑制率，公式如下：

校正直徑=平均直徑-菌餅直徑 （2）

抑制率（%）=×100% （3）

1.3.2 孢子萌發法 以孢子萌發法[8]（懸滴法）測定辛夷的6種溶劑提取物對病原菌孢子萌發的抑制作用。提取物終濃度分別為4 000，2 000，1 000，500，250 mg/L，3次重復，根據下列公式計算抑制率：

萌發率（%）=孢子萌發數/檢查孢子總數×100% （4）

抑制率（%）=×100%（5）

1.4 數據分析方法

應用Microsoft Excel軟件處理數據；采用SPSS 10.0軟件建立毒力回歸曲線，將抑菌的百分率轉換成幾率值，濃度轉換成對數，進行幾率值分析，分別求出辛夷的6種溶劑提取物對灰葡萄孢菌的抑制濃度（EC50）[9]；利用DPS v3.01專業版軟件，采用Duncar新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 辛夷提取率

采用6種溶劑對辛夷進行順序提取，計算各樣品的提取率，結果如表1所示。

提取率的高低反映植物材料在溶劑中溶解量的多少。由表1可以看出：各種溶劑之間的提取率差別較大，其中去離子水對辛夷的提取率最高，為12.06%；石油醚的提取率次之，為9.63%；丙酮的提取率最低，為1.99%。

2.2 辛夷6種順序提取物對黃瓜灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用

辛夷提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長的抑制作用分別如表2和表3所示。

由表2可以看出：辛夷的6種順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長起抑制作用，但各溶劑提取物之間的差距較大；石油醚提取物的抑菌效果最好，其次為丙酮提取物，在4 000 mg/L濃度時，抑菌率分別為99.19%和97.40%；乙醇的提取物抑菌效果最差，在

4 000 mg/L時，抑菌率僅為76.96%。

由表3可以看出：各提取物的相關系數均大于0.900 0，相關性較高；EC50最小的是氯仿提取物，為229.84 mg/L；其次為丙酮提取物，為316.48 mg/L；去離子水的EC50較高，為845.44 mg/L；菌絲EC50最高的為乙醇提取物，為1 019.82 mg/L。相對來說，溶劑極性越小，其提取物對菌絲的抑制效果越明顯。

2.3 辛夷6種順序提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制作用

辛夷提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發的抑制濃度（EC50）如表4和表5所示。

由表4可以看出：辛夷的6種順序提取物對灰葡萄孢菌孢子萌發均有抑制作用；在濃度為4 000 mg/L時，石油醚提取物抑制效果最好，孢子萌發抑制率為79.50%；丙酮提取物與水提取物的抑菌效果都較差，孢子萌發抑制率分別為47.26%和46.17%，均不到50.00%。

由表5可以看出：石油醚提取物對孢子萌發的EC50最小，為1 318.92 mg/L；其次為氯仿提取物，EC50為1 965.50 mg/L；EC50最大的是水提取物，為

4 321.80 mg/L。由此可以看出，溶劑的極性越小，其提取物對孢子萌發的抑制作用越明顯。

3 結論與討論

采用順序提取法，用6種溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、水）對辛夷進行提取。結果表明：去離子水的提取率最大，為12.06%；石油醚次之，為9.63%。

采用生長速率法測定各樣品對菌絲生長的抑制作用，孢子萌發法測定各樣品對孢子萌發的抑制作用。結果表明：辛夷6種溶劑的順序提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發均有抑制作用；其中，石油醚、氯仿提取物對菌絲生長的EC50分別為372.15 mg/L和229.84 mg/L，對孢子萌發的EC50分別為

1 318.92 mg/L和1 965.50 mg/L，抑菌效果較好；水提取物對菌絲生長和孢子萌發的EC50分別為845.44 mg/L和4 321.80 mg/L，抑菌效果相對較差。

綜上說明，辛夷中的一些物質雖易被去離子水提取，但這些物質沒有抑菌活性。辛夷的主要抑菌活性物質為脂溶性物質，易被有機溶劑提取，且溶劑極性越小，提取液對孢子萌發的抑制效果越明顯；用單一溶劑提取辛夷的有效成分時，可以選擇石油醚或氯仿，以及與兩者極性相當或極性處于兩者之間的溶劑。6種測試溶劑提取物對菌絲生長的抑制效果優于對孢子萌發的抑制效果。

目前，國內利用植物粗提物抑制病原菌的研究還有很多。如王桂清[10]通過采用生長速率法和孢子萌發法測定了遼細辛根的不同溶劑（石油醚、氯仿、乙酸乙酯、乙醇）粗提取物對灰葡萄孢菌菌絲生長和孢子萌發的抑制作用，發現細辛的不同溶劑提取物對灰葡萄孢菌的菌絲生長和孢子萌發均有一定的抑制作用，并且對孢子萌發的抑制效果要好于對菌絲生長的抑制效果；其中石油醚提取物的抑菌效果較好，其對菌絲生長的EC50分別為177.44 mg/L與159.98 mg/L，對孢子萌發的EC50分別為173.23 mg/L與125.29 mg/L。王樹桐等[11]研究了丁香的甲醇提取物對番茄灰霉病菌的抑制效果，發現當提取物濃度為20 000 mg/L和

10 000 mg/L時，對菌絲的抑制率達到80%以上，當提取物濃度為10 000 mg/L時，完全抑制孢子的產生，濃度為5 000 mg/L時，對產孢的抑制率為85.40%，濃度進一步稀釋的話則不再表現顯著抑制作用。國內對辛夷的抑菌作用也有所研究。李紅梅等[3]測試了123種中草藥提取物對板藍根根腐病菌（Fusarium solani）菌絲生長及孢子萌發的抑制作用，發現辛夷提取物0.01 g/mL濃度時對菌絲生長的抑制率為11.58%，對孢子萌發的抑制率為6.00%。王樹桐等[4]研究測試了123種常見中草藥提取物對香蕉鐮刀菌枯萎病病原菌（F. oxysporum）的抑菌作用，發現辛夷提取物1%的濃度對菌株B1和B2的菌絲生長抑制率分別為76.56%和24.73%，對孢子萌發的抑制率分別為40.06%和61.62%。

眾多的研究結果表明，利用一些植物提取物來作為植物源殺菌劑是可行的，且發展前景較為廣闊。為了能夠更好地利用植物源殺菌劑，研究清楚其有效成分勢在必行。辛夷含有的抑菌活性物質可能不止一種，各物質之間的抑菌活性可能是相輔相成的，可進行層析分離和質譜分析，進一步測定各分離物質對灰葡萄孢菌的抑菌活性。

參考文獻

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[2] 王永慧，葉方，張秀華.辛夷藥理作用和臨床應用研究進展[J].中國醫藥導報，2012，9（16）：12-14.

[3] 李紅梅，曹靜，張鳳巧.中草藥提取物對板藍根根腐病菌抑制作用研究[J].河南農業科學，2009（6）：100-104.

[4] 王樹桐，黃惠琴，方哲.中草藥提取物對香蕉鐮刀菌枯萎病病原菌的抑制作用[J].熱帶作物學報，2008，29（1）：78-82.

[5] 唐裕芳，張妙玲，陶能國，等.蒼術揮發油的提取及其抑菌活性研究[J].西北植物學報，2008，28（3）：588-594.

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[9] 華南農業大學.植物化學保護[M].北京：農業出版社，1998.

[10] 王桂清.遼細辛提取物對灰葡萄孢菌的抑制效果[J].植物保護，2008，34（2）：53-57.

[11] 王樹桐，曹克強，張鳳巧，等.中藥丁香提取物對番茄灰霉病菌抑制作用及生防效果研究[J].植物病理學報，2005，35（6）：91-94.