微波協同酶法提取刺玫葉總黃酮工藝研究

王曉林，鐘方麗，薛健飛，單雪娜

（吉林化工學院 化學與制藥工程學院，吉林 吉林132022）

山刺玫（Rosa davurica）系薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布于東北、山西、內蒙古等地。其果實富含皂苷、黃酮、多糖等活性成分［1-3］，具有降血糖、降血壓、除血栓、抗衰老及保肝等眾多藥理作用［4-6］，是一種經濟價值極高的食、藥同源的寶貴資源。有關山刺玫果已有詳細研究［7-10］，目前關于刺玫葉研究的很少，而刺玫葉與果相比資源更豐富，價廉易得，本課題組采用HPLC法和UV法對刺玫葉中金絲桃苷和總黃酮含量進行了測定［11］，為了進一步提高刺玫葉的應用價值，對微波協同酶法提取刺玫葉總黃酮的工藝進行了初步探索，酶法提取是近年來應用較廣泛的一種植物有效成分提取新技術，具有高效、無毒、條件溫和、易于控制、能保持生物活性等優點［12-13］，如酶法輔助提取沙棘果渣、枸杞、銀杏葉總黃酮等［14-16］。本研究將為刺玫葉的進一步開發提供了基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑 刺玫葉采自吉林市豐滿區小白山，經吉林化工學院藥學系薛健飛博士鑒定為薔薇科薔薇屬植物山刺玫（Rosa davurica），秋季采收，除去雜質，晾干，置干燥處保存；蘆丁，中國食品藥品檢定研究院（供含量測定用）；木瓜蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；纖維素酶，湖南紅鷹祥生物股份有限公司；果膠酶，上海金穗生物科技有限公司；三氯化鋁、醋酸、醋酸鈉、無水乙醇均為分析純，天津市大茂化學試劑廠；水為重蒸餾水；其余所用試劑均為化學純。

1.1.2 儀器與設備 微波輻射萃取儀，MAS-Ⅱ型，上海新儀微波化學科技有限公司；紫外可見分光光度計，TU-1810型，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品23.2mg于100mL容量瓶中，60%乙醇溶解并定容。精密量取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mL于25mL容量瓶中，加60%乙醇至6mL，再加入5mL 0.1moL·L-1的三氯化鋁溶液及2.5mL 0.2moL·L-1pH值為5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，60%乙醇溶液定容，搖勻，置于40℃水浴中加熱15min，冷卻至室溫，以顯色劑為空白對照，在405nm處測定吸光度值。以蘆丁對照品濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，進行直線回歸，回歸方程：A=27.147C-0.022 6，R=0.999 6。結果表明在4.64～32.48μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

1.2.2 樣品含量測定 精密吸取刺玫葉提取液適量于25mL容量瓶中，按“1.2.1”項下所述方法進行測定，以相應刺玫葉提取液為空白，在405nm波長處測吸光度，計算出總黃酮提取率，計算公式如下：

刺玫葉總黃酮提取率（mg·g-1）=總黃酮的質量／刺玫葉的質量

1.2.3 酶法提取刺玫葉總黃酮的試驗 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，加入25倍量的75%乙醇，加入適宜的酶，在合適的溫度、pH值等條件下酶解，過濾，合并提取液，按1.2.2節方法測定刺玫葉提取液中總黃酮含量，以總黃酮提取率為指標，分別考察酶種類及其用量、提取時間、提取液pH值、提取溫度、提取次數對總黃酮提取率的影響，并在單因素試驗基礎上，對主要影響因素進行正交試驗［17-20］。

2 結果與分析

2.1 酶法提取刺玫葉總黃酮的單因素試驗

2.1.1 酶種類及其用量對總黃酮得率的影響

2.1.1.1 纖維素酶 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5 g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，pH 5.0條件下，選擇不同用量的纖維素酶（20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120 min，90℃、30s滅酶，過濾，記錄提取液體積，吸取提取液適量于25mL容量瓶中，按1.2.2節方法測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率，確定最佳纖維素酶用量。

2.1.1.2 果膠酶 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的果膠酶（20、30、40、50、60、70、80 mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1節。

2.1.1.3 復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶1、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1。

2.1.1.4 復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶2） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復合酶（纖維素酶∶果膠酶=1∶2、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1。

2.1.1.5 復合酶（纖維素酶∶果膠酶=2∶1） 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，選擇不同用量的復合酶（纖維素酶∶果膠酶=2∶1、20、30、40、50、60、70、80mg·g-1）酶解120min，其他條件同2.1.1.1（圖1）。

圖1 酶種類及用量的影響Fig.1 The influence of varieties and amount of the enzyme

由圖1得知，隨著纖維素酶用量的增加，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，當纖維素酶用量為60mg·g-1時，刺玫葉總黃酮提取率達到19.48mg·g-1，繼續增加纖維素酶用量提取率提高幅度較小，因此，纖維素酶用量確定為60mg·g-1。果膠酶用量對刺玫葉總黃酮提取率影響趨勢與纖維素酶相似，但提取率低于纖維素酶。當復合酶（纖∶果=1∶1）用量由20mg·g-1增加到60mg·g-1時，刺玫葉總黃酮提取率隨之提高，當復合酶用量＞60 mg·g-1時，提取率略有下降。隨復合酶（纖∶果=1∶2）用量的增加，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，對刺玫葉總黃酮提取率影響趨勢與纖維素酶相似，但提取率低于纖維素酶。當復合酶（纖∶果=2∶1）用量由20mg·g-1增加到60mg·g-1時，總黃酮提取率逐步提高，達到22.02mg·g-1，繼續增加復合酶用量提取率提高幅度較小。根據對酶種類及用量的單因素試驗結果可知，使用復合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮其提取率高于其他酶，所以選擇復合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮，其最佳用量為70mg·g-1。

2.1.2 提取時間對總黃酮提取率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH 5.0條件下，分別酶解提?。?.5、1.0、1.5、2.0、2.5h），其他操作同2.1.1.1節（圖2）。

圖2 提取時間的影響Fig.2 The influence of extraction time

由圖2可知，隨著酶解時間的延長，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，在酶解時間達到2.0h時提取率達到最高值，再延長酶解時間，提取率反而下降，因此選擇最佳酶解時間為2.0h。

2.1.3 pH對總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，酶解溫度控制在45℃，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，分別于pH（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）條件下酶解提取2.0 h，其他操作同2.1.1.1節（圖3）。

由圖3可知，隨著pH值的升高，刺玫葉總黃酮提取率逐漸增大，當pH=4.5時提取率達到最高值，pH值再提高時，提取率開始逐漸下降，因此確定酶解的最佳pH值為4.5。

2.1.4 溫度對總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH4.5條件下分別在30、35、40、45、50、55、60℃酶解提取2.0h，其他操作同2.1.1.1節（圖4）。

圖3 pH值的影響Fig.3 The influence of pH

圖4 提取溫度的影響Fig.4 The influence of extraction temperature

由圖4可知，隨著酶解溫度的升高，刺玫葉總黃酮提取率逐漸提高，當溫度達到55℃時，提取率上升到最高值，溫度再提高，提取率開始下降，說明此條件下55℃是最佳酶解溫度。

2.1.5 提取次數對總黃酮得率的影響 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH4.5條件下在55℃酶解提取2.0h，然后將提取殘渣按上述條件（不加酶）分別進行第2、3、4、5次提取，其他操作同2.1.1.1節（圖5）。

圖5 提取次數的影響Fig.5 The influence of extraction times

2.2 酶法提取刺玫葉總黃酮的正交試驗

2.2.1 因素及水平的考察 在上述單因素試驗的基礎上，以刺玫葉總黃酮提取率為考察指標，選擇復合酶（纖∶果=2∶1）用量、提取時間、pH值和提取溫度作為考察因素進行正交試驗，優化刺玫葉總黃酮的酶解提取工藝。按四因素三水平進行正交試驗設計L9（34）（表1），在此條件下對刺玫葉總黃酮進行酶解提取，按1.2.2節方法測定提取液的吸光度，計算總黃酮提取率。

表1 正交試驗Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

2.2.2 正交試驗結果 取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，按正交試驗表進行試驗，每組試驗的提取溶劑均為75%乙醇，料液比為1∶25，提取2次（表2）。

表2 正交試驗結果Table 2 Experimental data of orthogonal tests

正交試驗結果表明，復合酶（纖∶果=2∶1）輔助提取刺玫葉總黃酮各因素的影響大小為：復合酶（纖∶果=2∶1）用量＞酶解時間＞pH值＞酶解溫度，刺玫葉總黃酮的最佳酶解提取工藝條件為A2B2C2D2，即料液比為1∶25，提取溶劑為75%乙醇，復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1，pH值為4.5，提取溫度為55℃，酶解提取時間為120min，提取次數2次。

2.3 酶法提取刺玫葉總黃酮工藝穩定性驗證試驗

取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入到提取燒瓶中，加入25倍生藥量的75%乙醇和0.175g復合酶（纖∶果=2∶1），酶解溫度控制在55℃，控制提取液于pH值4.5條件下酶解提取2次，每次120min，其他操作同2.1.1.1。按上述工藝條件重復試驗3次。結果刺玫葉總黃酮提取率分別為29.67、30.32、30.41 mg·g-1，平均為30.13mg·g-1，結果表明優選的刺玫葉總黃酮酶解提取工藝比較穩定。

2.4 微波協同酶法提取刺玫葉總黃酮試驗

取刺玫葉粗粉適量，稱取2.5g，放入提取燒瓶中，按酶解提取最佳條件提取，然后在微波功率600 W，控制微波溫度60℃條件下提取2次，每次15 min，3次試驗刺玫葉總黃酮提取率分別為31.87、32.64、32.12mg·g-1，平均為32.21mg·g-1，結果表明微波協同后刺玫葉總黃酮提取率比酶法提高2.08mg·g-1。

3 結論

本試驗采用單因素和正交試驗法對微波協同酶法提取刺玫葉總黃酮的工藝進行了優化。其最佳工藝條件為：提取溶劑為75%乙醇、料液比1∶25、復合酶（纖∶果=2∶1）用量70mg·g-1、酶解溫度55℃、酶解時間120min、酶解提取2次、酶解體系pH4.5、微波功率600W，微波處理時間15min、微波溫度60℃、微波提取2次，在此工藝條件下，刺玫葉總黃酮提取率為32.21mg·g-1。

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