Toll樣受體與急性膽管炎關系的研究進展

刻浩潤 趙洪強 李為民

1.解放軍醫學院，北京 100853；2.解放軍第三〇九醫院肝膽外科，北京 100091

Toll樣受體與急性膽管炎關系的研究進展

刻浩潤1，2趙洪強1，2李為民2▲

1.解放軍醫學院，北京 100853；2.解放軍第三〇九醫院肝膽外科，北京 100091

急性膽管炎（AC）是腹部外科中的常見疾患，其嚴重型（急性重癥膽管炎）具有發病兇險，預后不良的特點。膽管存在梗阻的基礎上并發腸道菌群易位、滋生是造成AC的最主要致病因素，而造成膽管感染的主要是革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌，其毒力主要體現在細菌外膜成分——脂多糖（LPS）上。LPS從細菌外膜釋放出來，通過誘導體內單核/巨噬細胞合成并釋放多種炎癥介質進而參與免疫炎癥反應。LPS主要通過Toll樣受體（TLR）來發揮致炎效應。近年來有關TLR在AC發病過程中作用的研究得到了進展，為理解AC的免疫病理過程提供了新的線索。

Toll樣受體；急性膽管炎；免疫病理

急性膽管炎（acute cholangitis，AC）是腹部外科常見疾患，革蘭氏陰性菌外膜成分——脂多糖（LPS）被認為是誘導炎癥發生，造成疾病發生、發展的關鍵因素。隨著免疫學和分子生物學技術的發展，作為LPS主要配體的Toll樣受體 （Toll like receptor，TLR）在AC發生、發展過程中的作用得到關注。研究提示，TLR 在AC造成肝臟損傷的病理過程中起關鍵作用，其作用方式可能與其介導的LPS損毀膽管細胞緊密連接的過程有關。明確TLR在AC中的作用可為將來揭示AC的免疫病理提供新的線索。

1 AC是影響人類健康的重要疾病

AC是在膽管梗阻基礎上并發的細菌感染。感染往往不僅局限于膽管本身，還能夠播散全身，最終對其他臟器造成嚴重影響，尤其是肝臟。膽總管結石或者存在于膽管的膽囊結石是造成AC的最主要原因［1-2］。由于缺乏大宗病例流行病學調查，據估計世界范圍內健康人群中有10%患有膽囊結石［3-4］，有10%～20%的有癥狀的膽囊結石患者會并發膽總管結石［5-9］，而在這類人群中有0.2%的患者可能出現AC的癥狀［10］。然而，上述只是從結石的角度去粗略估計AC的發生率，它并不能代表真正的發病率，因為還有其他誘因，例如原發性膽管結石、腫瘤和狹窄等沒有被考慮在內。

1877年首次被描述的Charcot三聯征——腹痛、發熱、黃疸至今仍是臨床診斷AC的主要方法。大多數AC患者在應用抗生素后癥狀會得到緩解，而最終治愈這類疾病往往還需疏通膽管阻塞［11］。盡管大部分患者在接受抗生素和膽管疏通治療后能夠痊愈，但研究顯示該疾病病死率仍高達10%［12-13］。

對于膽管形態及功能正常的健康個體來說，膽汁中是沒有細菌存在的，然而在病理情況下，細菌則可能通過壺腹（排石、乳頭括約肌切開術或支架置入術后）或門脈（菌血癥情況下細菌由肝血竇轉移至膽管）進入膽管從而感染整個膽管系統［14-19］。對于健康個體來說，由于膽汁流動所起到的沖刷作用以及膽汁中的抗菌成分（膽鹽和膽汁IgA），細菌的侵入并不一定意味著AC的發生，而這一情況如果發生在膽管存在梗阻的情況下，AC發生的概率就大大增高了，原因在于梗阻情況下的膽管影響了膽汁的流動和IgA的產生，導致肝巨噬細胞功能以及膽管緊密連接受損，甚至引發膽管靜脈反流的發生［16，19-23］。正常的膽管內壓力為7～14 cm H2O，而當膽管壓力增加至＞20 cm H2O時則能夠促使細菌逆行進入循環系統，從而造成全身反應［14］。

造成AC最常見的病原體為革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌。嚴重的AC有可能進一步發展成為膿毒血癥、系統性炎癥反應綜合征，甚至多器官功能障礙。研究認為，誘導AC致命病理過程的最主要因素在于機體免疫細胞對細菌的非適應性反應，而TLR是機體識別細菌毒力成分的主要受體家族之一，被認為在AC發病過程中起關鍵作用。

2 TLR是介導天然免疫反應的重要受體系統

對TLR的研究最早從果蠅開始。此后，研究不斷深入，迄今人們已經發現了9種果蠅TLR（dTLR）和10種人TLR（hTLR），分別被命名為TRLl～10［24］。hTLR是與果蠅Toll蛋白具有同源性的表達于細胞膜上與免疫系統識別微生物有關的一類受體家族，能夠識別特定類型微生物的保守的分子成分，即病原體相關分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs）。

人類的TLR蛋白屬于Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區、跨膜段和胞內區3部分組成，其胞外區由18～31個富含亮氨酸的重復序列和半胱氨酸結構（半胱氨酸殘基形成鏈內二硫鍵襻）所組成，這種結構可以加強蛋白質之間的黏附，與病原體及其產物的特異性識別有關。胞內段大約為200個氨基酸大小與人白介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）胞質區結構相似，稱為Toll樣受體/白介素-l同源結構域（Toll/IL-1-receptor Homo-logous Region，TIR），是TLR和IL-1R向下游傳導信號的核心元件［25］。

TLR在淋巴組織和非淋巴組織均有表達，但不同的TLR在不同的組織和細胞表達量有所不同。大多數TLR配體都歸類于PAMPs，如細菌DNA中未甲基化的CpG基序和肽聚糖、革蘭氏陰性菌的LPS、革蘭氏陽性菌的磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、RNA病毒的dsRNA，許多微生物和寄生蟲表面的以Man、ManNAc、GlcNAe、Fuc等為末端糖基的糖結構，支原體、螺旋體的膜脂蛋白、分枝桿菌的糖脂肽、脂阿拉伯甘露糖、酵母菌的甘露聚糖以及病毒的雙鏈DNA［26］。眾多研究結果表明，TLR對配體的識別需要其他蛋白的協同作用。CD14是一個在TLR的功能中起關鍵作用的蛋白質分子。它主要有兩個作用：①接受血漿中的LPS結合蛋白（LPS-binding protein，LBP）呈遞的、由細菌表面脫落下來的LPS，形成的膜表面的LPS/CD14/ LBP復合物可活化LPS應答細胞；②作為活化信號傳導的中介，因CD14缺乏胞內域，為使活化信號得以在胞內繼續傳遞，需要和由另一個協同受體MD2與TLR4所形成的TLR4-MD2復合物相聯系。MD2是一種可溶性蛋白分子，通過與TLR4的胞外域結合，活化LPS介導的NF-κB途徑，且為LPS依賴的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）活化所必需［27］。TLR主要通過髓樣分化因子88依賴性和非髓樣分化因子88依賴兩條途徑最終引發致炎基因表達［28-29］。

3 TLR在AC致病過程中起關鍵作用

3.1 TLR參與AC致肝臟損傷的病理過程

嚴重型AC意味著在膽管炎的基礎上并發了其他器官的損傷，而肝臟往往是最常見的受損器官之一。在利用大鼠構建的AC模型中，研究人員發現，TLR4在AC致肝臟損傷過程中起關鍵作用。Yu等［30］在大鼠AC模型中，首先利用病理檢測的方法確認了離“病原地”最近的肝臟組織的損傷情況。進一步研究發現，受損的肝臟細胞內TLR4和NF-κB的表達較對照組相比呈顯著升高趨勢，且無論在基因還是在蛋白水平，TLR4在大鼠AC模型構建1 h后即開始升高。在術后6 h觀測到表達的高峰。進而還發現，TLR4表達的變化水平與肝臟細胞NF-κB和血清中TNF-α變化水平保持一致，因而，研究者認為在大鼠AC模型中，肝臟細胞TLR4高表達與其損傷密切相關，TLR4通過激活NF-κB和釋放促因子如TNF-α來發揮其致病效應。

如前所述，MD-2在TLR和LPS之間起橋接作用，在TLR介導LPS信號轉導過程中起關鍵作用。2004年，Ohta等［31］利用RT-PCR技術擴增出了一種MD-2的剪接體——MD-2B。研究顯示，MD-2B能夠以劑量依賴性阻斷TLR4/MD-2/LPS介導的NF-κB信號轉導過程。進而，Miao等［32］在AC大鼠模型中觀察到了MD-2、MD2B在疾病過程中的作用。研究發現，肝臟TLR4和MD-2mRNA表達水平在AC大鼠模型建立的6、12、24、48、72 h間逐漸上調，而MD-2B mRNA水平則呈下降趨勢。在對AC大鼠應用TLR4抑制劑后，TLR4、MD-2 mRNA表達與AC對照組相比顯著下降，而MD-2B則表達上調。MD-2BmRNA表達水平與MD-2、TLR4mRNA水平呈負相關。筆者認為，在大鼠AC模型中，MD-2在TLR4介導的肝臟損傷中起重要作用，而MD-2B則作為負向調控蛋白而存在。

3.2 TLR介導了LPS損毀膽管細胞緊密連接的過程

正常的膽管上皮細胞構成一道屏障，防止膽汁逆流進入肝臟實質。膽管上皮細胞間的緊密連接是構成這一屏障的重要結構。病理情況下，緊密連接的結構和功能受到影響，造成膽汁成分逆流，進而引發肝臟甚至系統性炎癥反應［33］。研究發現，LPS具有毀損緊密連接的作用，而這一作用是通過TLR4介導的。緊密連接由多種特殊蛋白分子組合而成，如閉鎖蛋白（Occludin），緊密連接蛋白（Zonula occludens，ZO），閉合蛋白（Claudins）以及連接黏附分子（junctional adhesionmolecule）等［34］。緊密連接蛋白分子與周圍肌動球蛋白環相互作用。此外，一系列胞內信號分子，如c-Src、磷脂酰肌醇3激酶、ERK、PKCζ以及PP2A在緊密連接富集［35-36］。大量證據顯示，緊密連接以及細胞旁通透性受諸如胞內鈣離子、環磷酸腺苷、GTP酶轉換蛋白、蛋白激酶等多種信號分子的調控［37-38］。Sheth等［39］研究發現，LPS能夠以時間和劑量依賴的特性去影響膽管單層細胞模型的屏障功能和細胞旁通透性。LPS能夠誘導細胞間連接處的緊密連接蛋白，閉鎖蛋白等的再分布，減少ZO-1的表達水平。在酪氨酸激酶抑制劑的作用下上述效應顯著減輕，研究發現其效應體現在抑制了LPS誘導閉鎖蛋白去磷酸化作用，進而通過siRNA技術沉默c-Src、TLR4或LBP的表達均能減弱LPS誘導的緊密連接功能下降的現象。ML-7是一種肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑，也被證實能夠減弱LPS誘導細胞旁通透性的增加的現象。筆者認為，LPS的存在能夠顯著影響緊密連接的功能，而這一效應是通過c-Src、TLR4、LBP和肌球蛋白輕鏈激酶依賴的機制誘導的。

綜上所述，目前研究已明確揭示TLR在AC炎癥的發生、發展過程中扮演了重要角色。TLR是機體啟動天然免疫系統從而應對感染的重要成分，明確其在AC中的作用可為將來揭示AC的免疫病理提供新的線索。將來圍繞天然和獲得性細胞免疫系統進行研究，我們將獲得更多的有關AC免疫機制的知識和規律，進而為研究調控AC免疫，防治重癥AC發生提供線索和方向。

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Research Progress of the relationshiP between Toll like recePtor and acute cholangitis

LIU Hao-run1，2ZHAO Hong-qiang1，2LIWei-min2▲
1.Medical College of PLA，Beijing 100853，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，the 309thHospital of PLA，Beijing 100091，China

Acute cholangitis（AC）is a common disease of abdominal surgery with features of dangerous and poor prognosis for its severe type（acute severe cholangitis）.Themain factor causing AC is believed to be the intestinal flora shift and breeding on the basis of biliary obstruction.Biliary tract infection ismainly caused by Gram negative bacteria，such as Escherichia coli，and its toxicity ismainly reflected in the bacterial outermembrane component（lipopolysaccharide，LPS）.LPS released form bacterial outermembrane participates in immune and inflammatory reaction through inducing the synthesis and releasing various inflammatory mediators of mononuclear macrophage in vivo monocytes/ macrophages.LPSmainly through Toll like receptor （TLR）to play the inflammatory effect.In recent years，research on the effect of TLR in the pathogenesis of AC had gain developmentwhich provides us new clue for the understanding of the immune pathological process of AC.

Toll like receptors；Acute cholangitis；Immune pathogenesis

R575.6+1

A

1674-4721（2015）02（c）-0013-04

2014-12-03本文編輯：許俊琴）

▲通訊作者