促紅細胞生成素對血管緊張素Ⅱ誘導的系膜細胞增殖及Ⅰ/Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白表達的影響研究

季 芬，徐玉音，范亞平，王 鋒，楊 斌

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·論著·

促紅細胞生成素對血管緊張素Ⅱ誘導的系膜細胞增殖及Ⅰ/Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白表達的影響研究

季 芬，徐玉音，范亞平，王 鋒，楊 斌

目的 探討促紅細胞生成素(EPO)對血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導的系膜細胞增殖及Ⅰ型膠原(ColⅠ)、Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)和纖維連接蛋白(FN)表達的影響。方法 將體外培養大鼠腎小球系膜細胞分為4組：對照組，AngⅡ組(0.1、1.0、10.0 μmol/L)，EPO組(1、10、100 U/L)，AngⅡ+EPO組(EPO 1、10、100 U/L預處理1 h后加AngⅡ 1.0 μmol/L)。各組處理0、24、48 h時，CCK-8法檢測系膜細胞增殖情況，免疫印跡法檢測系膜細胞ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平，ELISA法檢測系膜細胞培養上清液中ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平。結果 單獨給予AngⅡ或EPO均可刺激系膜細胞增殖，AngⅡ組亞組和EPO組亞組24、48 h時系膜細胞增殖水平均高于對照組，且48 h時高于24 h時，24 h時高于0 h時，差異均有統計學意義(P<0.05)；單獨給予AngⅡ或EPO均可促進系膜細胞合成及分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN，除EPO 1 U/L亞組Col Ⅰ蛋白表達水平與對照組間差異無統計學意義(P>0.05)外，AngⅡ組亞組和EPO組其他亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。與AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L亞組比較，AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 10 U/L亞組和AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 100 U/L亞組在24、48 h時系膜細胞增殖水平及ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05)，但與對照組及同濃度單純EPO亞組比較，AngⅡ1.0 μmol/L+EPO組各亞組24、48 h時系膜細胞增殖水平及ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 Ang Ⅱ能刺激系膜細胞增殖，促進系膜細胞合成及分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN，EPO亦有一定程度類似作用，但兩者同時存在時，EPO可拮抗AngⅡ誘導的系膜細胞增殖及ColⅠ、Col Ⅳ和FN的合成及分泌，提示EPO除可糾正腎性貧血外，可能對AngⅡ誘導的腎小球硬化具有抑制作用而保護腎功能。

促紅細胞生成素；血管緊張素Ⅱ；腎小球系膜細胞；膠原Ⅰ型 ；膠原Ⅳ型；纖連蛋白類

季芬，徐玉音，范亞平，等.促紅細胞生成素對血管緊張素Ⅱ誘導的系膜細胞增殖及Ⅰ/Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白表達的影響研究[J].中國全科醫學，2015，18(26)：3177-3181.[www.chinagp.net]

Ji F,Xu YY,Fan YP,et al.Effects of erythropoietin on ang Ⅱ-induced mesangial cell proliferation and the expression levels of col Ⅰ,Col Ⅳ and FN[J].Chinese General Practice，2015，18(26)：3177-3181.

促紅細胞生成素(EPO)是哺乳動物調節紅細胞生成的主要因子，出生后主要產生于腎臟，基本生理功能是刺激骨髓紅細胞生成和釋放；重組EPO是慢性腎衰竭貧血治療的重大進展，目前已在臨床廣泛應用。近來研究顯示，EPO可通過減輕足細胞損傷及改善腎小球內皮細胞功能而減輕或延緩腎小球硬化[1-2]。系膜細胞是腎小球固有細胞，其增殖及Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、Ⅳ型膠原(Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)等系膜細胞外基質(ECM)成分的過度合成和積聚在腎小球硬化過程中具有重要的病理作用，但鮮有EPO與腎小球系膜細胞及腎小球硬化相關的研究報道。本研究擬采用體外培養腎小球系膜細胞分別予不同濃度血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)或EPO單用及共同刺激，觀察腎小球系膜細胞增殖、ECM有關成分合成與分泌的改變，探討EPO對AngⅡ刺激所致腎小球系膜細胞增殖與ECM聚積的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1由中國典型培養物保藏中心提供，DMEM培養基購自美國Gibco BRL公司，胎牛血清購自美國Invitrogen公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司，AngⅡ購自美國Enzo公司，EPO購自山東阿華生物藥業有限公司，兔抗鼠ColⅠ抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗鼠Col Ⅳ抗體、兔抗鼠FN抗體購自美國Immunoway公司，兔抗鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗購自上海碧云天生物技術研究所，大鼠ColⅠ、Col Ⅳ及FN ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司。

1.2 細胞培養與分組干預 DMEM培養液(含10%胎牛血清)培養大鼠系膜細胞；待80%融合予無血清培養24 h使細胞同步化后分為4組：對照組，AngⅡ組(0.1、1.0、10.0 μmol/L)，EPO組(1、10、100 U/L)，AngⅡ+EPO組(EPO 1、10、100 U/L預處理1 h后加AngⅡ 1.0 μmol/L)。

1.3 CCK-8法檢測大鼠系膜細胞增殖 系膜細胞以每孔5×104的密度接種于96孔板，貼壁生長至80%融合后分組予干預處理48 h，于0、24、48 h時加CCK-8 10 μl /孔，37 ℃避光孵育2 h，采用酶標儀于450 nm波長測定各孔吸光度(A)值。

1.4 免疫印跡法檢測系膜細胞合成ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白的水平 系膜細胞培養至80%融合按上述分組予干預處理48 h，4 ℃ 0.01 mmol/L PBS洗滌3次，棄上清液；加細胞裂解液冰上孵育30 min，離心后取上清液測定蛋白濃度，取等量蛋白SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜，5% BSA封閉2 h，TBST洗滌3次，分別加入兔抗鼠ColⅠ、Col Ⅳ、FN抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，BIO-RAD顯影儀顯影，用Image J圖像分析軟件掃描并測定灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值與對照組灰度比值的百分比表示。

1.5 ELISA法檢測細胞培養上清液中ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平 取對數生長期系膜細胞以每孔1×105的密度接種于6孔板，分組予干預處理48 h，提取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平，采用酶標儀于450 nm波長測定各孔吸光度(A)值。

2 結果

2.1 AngⅡ或EPO對大鼠系膜細胞增殖的影響 單獨給予AngⅡ或EPO均可刺激系膜細胞增殖，AngⅡ組和EPO組各亞組24、48 h時系膜細胞增殖水平均高于對照組，且48 h時高于24 h時，24 h時高于0 h時，差異均有統計學意義(P<0.05)。

與AngⅡ1.0 μmol/L亞組比較，AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 10 U/L亞組和AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 100 U/L亞組在24、48 h時系膜細胞增殖水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與同濃度EPO亞組比較，AngⅡ+EPO組各亞組24、48 h時系膜細胞增殖水平增高，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table 1 Comparison of mesangial cell proliferation level among all groups at different times

組別0h24h48h對照組0.55±0.030.88±0.041.55±0.07AngⅡ組 AngⅡ0.1μmol/L亞組0.55±0.041.16±0.05ae1.92±0.09aef AngⅡ1.0μmol/L亞組0.57±0.05b1.35±0.06abe2.53±0.13abef AngⅡ10.0μmol/L亞組0.61±0.05b1.52±0.08abe2.76±0.14abefEPO組 EPO1U/L亞組0.59±0.030.91±0.05a1.60±0.08af EPO10U/L亞組0.56±0.03b1.02±0.05abe1.78±0.08abef EPO100U/L亞組0.57±0.04b1.14±0.05abe1.98±0.10abefAngⅡ+EPO組 AngⅡ1.0μmol/L+EPO1U/L亞組0.58±0.05d1.46±0.06ade2.56±0.13adef AngⅡ1.0μmol/L+EPO10U/L亞組0.59±0.04bcd1.37±0.06abcde2.27±0.11abcdef AngⅡ1.0μmol/L+EPO100U/L亞組0.56±0.03bcd1.29±0.05abcde2.14±0.11abcdefF值F交互=51.60,F組間=171.22,F時間=7265.77P值P交互<0.001,P組間<0.001,P時間<0.001

注：AngⅡ=血管緊張素Ⅱ，EPO=促紅細胞生成素；與同時間點對照組比較，aP<0.05；與同時間點、同組前一濃度亞組比較，bP<0.05；與同時間點單用AngⅡ1.0 μmol/L亞組比較，cP<0.05；與同時間點、同濃度單用EPO亞組比較，dP<0.05；與同亞組0 h比較，eP<0.05；與同亞組24 h比較，fP<0.05

2.2 免疫印跡法檢測大鼠系膜細胞ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達 單獨給予AngⅡ或EPO均可刺激系膜細胞合成ColⅠ、Col Ⅳ和FN，除EPO 1 U/L亞組Col Ⅰ 蛋白表達水平與對照組間差異無統計學意義(P>0.05)外，AngⅡ組亞組和EPO組其他亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

與AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L亞組比較，AngⅡ 1.0 μmol/L+EPO 10 U/L亞組和AngⅡ 1.0 μmol/L+EPO 100 U/L亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與同濃度單用EPO亞組比較，AngⅡ+EPO組各亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.3 ELISA法檢測細胞培養上清液中ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平 單獨給予AngⅡ或EPO均可刺激系膜細胞分泌ColⅠ、Col Ⅳ及FN，除EPO 1 U/L亞組FN表達水平與對照組間差異無統計學意義(P>0.05)外，AngⅡ組亞組和EPO組其他各亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

與AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L亞組比較，AngⅡ 1.0 μmol/L+EPO 10 U/L亞組和AngⅡ 1.0 μmol/L+EPO 100 U/L亞組ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與同濃度單用EPO亞組比較，AngⅡ+EPO組各亞組系膜細胞合成ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。

Table 2 Comparison of the expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN in mesangial cells among all groups

組別ColⅠ/β-actinColⅣ/β-actinFN/β-actin對照組0.04±0.000.08±0.000.20±0.01AngⅡ組 AngⅡ0.1μmol/L亞組0.05±0.00a0.12±0.01a0.25±0.01a AngⅡ1.0μmol/L亞組0.08±0.00ab0.23±0.01ab0.38±0.02ab AngⅡ10.0μmol/L亞組0.09±0.00ab0.27±0.01ab0.43±0.02abEPO組 EPO1U/L亞組0.04±0.000.11±0.01a0.21±0.01 EPO10U/L亞組0.05±0.00ab0.12±0.01ab0.23±0.01ab EPO100U/L亞組0.05±0.00a0.14±0.01ab0.26±0.01abAngⅡ+EPO組 AngⅡ1.0μmol/L+EPO1U/L亞組0.08±0.00ad0.23±0.01ad0.37±0.02ad AngⅡ1.0μmol/L+EPO10U/L亞組0.07±0.00abcd0.18±0.01abcd0.32±0.02abcd AngⅡ1.0μmol/L+EPO100U/L亞組0.06±0.00abcd0.16±0.01abcd0.29±0.01abcdF值106.67138.63125.26P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與同組前一濃度亞組比較，bP<0.05；與單用AngⅡ1.0 μmol/L亞組比較，cP<0.05；與同濃度單用EPO亞組比較，dP<0.05

3 討論

EPO是調節哺乳動物紅細胞生成的一種30.4 kD酸性糖蛋白激素，成人主要由腎臟腎小管周圍的間質細胞產生，通過與EPO受體(EPOR)結合發揮生理作用，臨床已廣泛應用于治療慢性腎臟病所致貧血。近年發現EPO具有促進紅細胞生成以外的組織臟器保護作用，對心血管、腎臟、腦和神經系統損傷等均有明顯的保護作用，在許多非造血組織中證實存在EPOR，EPO與其結合相互作用可誘導一系列的細胞保護效應，包括促有絲分裂、抗氧化應激、抑制凋亡以及通過動員骨髓內皮祖細胞促進血管修復等[3]。已有研究表明多種腎臟實質細胞包括腎小球系膜細胞、腎小管和集合管上皮細胞等亦有EPOR表達[4-6]，可能是EPO腎臟保護作用的生理基礎。有研究發現EPO可減輕缺血再灌注、5/6腎切除、環孢素腎毒性等動物模型中的腎小管損傷和腎間質纖維化，顯示EPO具有腎臟保護作用[7-8]。

注：1=對照組，2=EPO 1 U/L亞組，3=EPO 10 U/L亞組，4=EPO 100 U/L亞組，5= AngⅡ 0.1 μmol/L亞組，6= AngⅡ1.0 μmol/L亞組，7=AngⅡ10.0 μmol/L亞組，8=AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L亞組，9=AngⅡ1.0 μmol/L+ EPO 10 U/L亞組，10=AngⅡ1.0 μmol/L+ EPO 100 U/L亞組

圖1 各組大鼠系膜細胞ColⅠ、Col Ⅳ和FN蛋白表達水平

Figure 1 Expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN in mesangial cells of all groups

Table 3 Comparison of expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN in cell culture supernatant of all groups

組別ColⅠColⅣFN對照組9.07±0.3712.34±0.5928.04±1.23AngⅡ組 AngⅡ0.1μmol/L亞組12.53±0.50a15.96±0.73a35.59±1.65a AngⅡ1.0μmol/L亞組16.68±0.86ab21.78±1.26ab63.71±3.09ab AngⅡ10.0μmol/L亞組17.67±0.93ab23.49±1.20ab73.64±3.93abEPO組 EPO1U/L亞組10.09±0.31a13.64±0.67a30.49±1.68 EPO10U/L亞組11.39±0.36ab14.56±0.73ab32.10±1.64ab EPO100U/L亞組12.95±0.43ab16.02±0.89ab40.16±2.45abAngⅡ+EPO組 AngⅡ1.0μmol/L+EPO1U/L亞組16.31±0.75ae21.98±1.33ad64.44±3.71ad AngⅡ1.0μmol/L+EPO10U/L亞組14.87±0.66abcd20.38±1.33abcd59.38±2.90abcd AngⅡ1.0μmol/L+EPO100U/L亞組13.96±0.46abcd18.57±0.94abcd49.36±2.88abcdF值137.1590.62231.90P值<0.001<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與同組前一濃度組比較，bP<0.05；與單用AngⅡ1.0 μmol/L亞組比較，cP<0.05；與同濃度單用EPO亞組比較，dP<0.05

腎小球系膜細胞增殖、ECM合成和分泌增加與異常積聚是各種原發或繼發性腎臟疾病導致腎小球硬化的共同病理特征，也是造成腎功能進行性減退的重要病理基礎，AngⅡ在此病理過程中處于中心環節，可通過血流動力學因素作用于腎臟小血管加重高壓力、高灌注、高濾過以及血管切應力作用，間接促進系膜細胞增殖和ECM積聚，亦可由非血流動力學因素直接誘導系膜細胞增殖或刺激轉化生長因子 β、結締組織生長因子、成纖維細胞生長因子及白介素6等因子產生，進而促進系膜細胞增殖以及ECM合成增加與降解減少[9]。本研究顯示，AngⅡ可促進大鼠腎小球系膜細胞增殖以及系膜細胞合成與分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN，隨AngⅡ水平增加，系膜細胞增殖及合成與分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN更加明顯，與文獻研究結果一致[10]，證實AngⅡ是腎小球硬化病理過程的重要因子。同時本研究亦顯示，單用EPO刺激也可在一定程度上誘導系膜細胞增殖及合成分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN；但進一步發現兩者同時使用時，EPO對AngⅡ刺激所致系膜細胞增殖、ECM成分ColⅠ、Col Ⅳ及FN的高表達具有明顯的拮抗作用，并呈劑量相關，表明臨床上慢性腎臟病患者應用EPO除可糾正腎性貧血外，還可能對AngⅡ誘導的腎小球硬化病理過程發揮抑制作用而保護腎功能。本研究目前僅有體外實驗，相關機制和細胞信號途徑仍有待進一步深入研究明確。

作者聲明：文章為原創作品，數據準確，內容不涉及泄密，無一稿兩投，無抄襲，無內容剽竊，無作者署名爭議，無與他人課題以及專利技術的爭執，內容真實，文責自負。

本文要點：

本研究結果顯示，AngⅡ可促進大鼠腎小球系膜細胞增殖以及系膜細胞合成與分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN，單用EPO也可在一定程度上誘導系膜細胞增殖及合成分泌ColⅠ、Col Ⅳ和FN，兩者同時使用時，EPO對AngⅡ刺激所致系膜細胞增殖及ColⅠ、ColⅣ、FN的高表達有明顯的拮抗作用，并與劑量相關。本研究結果對于腎小球硬化機制以及應用EPO進行防治具有一定的理論指導價值和實踐意義，為進一步研究EPO除糾正貧血外的器官保護、延緩腎臟纖維化作用奠定了基礎。本研究選題較為新穎，國內外相關研究很少；但研究方法較為簡易，進行了體外實驗，僅測定了系膜細胞增殖及蛋白表達，有待于進一步行動物實驗探索具體作用機制及信號途徑。

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(本文編輯：趙躍翠)

Effects of Erythropoietin on Ang Ⅱ-induced Mesangial Cell Proliferation and the Expression Levels of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN

JIFen,XUYu-yin,FANYa-ping,etal.

DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

Objective To investigate the effects of erythropoietin on Ang Ⅱ-induced mesangial cell proliferation and the expression levels of Col Ⅰ,Col Ⅳ and fibronectin (FN).Methods Rat mesangial cells were cultured in virto and were divided into 4 groups:control group,Ang Ⅱ group (0.1,1.0,10.0 mol/L),EPO group (1,10,100 U/L),and Ang Ⅱ+ EPO group(mesangial cells were pretreated with EPO 1，10，100 U/L for 1 h,then AngⅡ 1.0 μmol/L was added).After 0 h，24 h，48 h treatment,mesangial cell proliferation was assayed by CCK-8; the expression levels of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN protein were detected by ELISA; the expression levels of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN in cell culture supernatant were detected by ELISA.Results Either Ang Ⅱ or EPO alone could stimulate mesangial cell proliferation; AngⅡ group and EPO subgroups were higher than control group in cell proliferation levels at 24 h and 48 h,and the cell proliferation levels at 48 h were higher than 24 h,and those at 24 h were higher than 0 h (P<0.05).Either Ang Ⅱ or EPO alone could stimulate the synthesis of mesangial cells and the secretion of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN;apart from EPO 1 U/L subgroup which was not significantly different from control group in the expression of ColⅠ(P>0.05),AngⅡ group and other EPO subgroups were all higher(P<0.05) than control group in the expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN.Compared with AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 1 U/L group,AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 10 U/L group and AngⅡ1.0 μmol/L+EPO 100 U/L group were lower in 24 h and 48 h mesangial cell proliferation levels and the expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN (P<0.05),while compared with control group and EPO subgroups of the same concentrations,AngⅡ1.0 μmol/L+EPO(1，10，100 U/L) subgroups were higher in 24 h and 48 h mesangial cell proliferation levels and the expression levels of ColⅠ,Col Ⅳ and FN(P<0.05).Conclusion Ang Ⅱ can increase the mesangial cell proliferation and promote the synthesis and secretion of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN.EPO has the similar effects in some extent.But when the cells were treated by EPO and Ang Ⅱ together,EPO can inhibit the AngⅡ-induced mesangial cell proliferation and decrease the synthesis and secretion of Col Ⅰ,Col Ⅳ and FN induced by AngⅡ.The result indicated that EPO not only curbs renal anemia,but also protects renal function by inhibiting glomerulosclerosis induced by Ang Ⅱ.

Erythropoietin;Angiotensin Ⅱ;Glomerular mesangial cells；Collagen type Ⅰ;Collagen type Ⅳ;Fibronectins

國家自然科學基金資助項目(81170689)；南通市社會事業科技創新與示范計劃項目(HS2011029)

226001江蘇省南通市，南通大學附屬醫院腎內科(季芬現工作單位為南通市第二人民醫院腎內科)

范亞平，226001 江蘇省南通市，南通大學附屬醫院腎內科；E-mail:fanyp19107@medmail.com.cn

R 322.61

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.26.013

2015-03-25；

2015-07-15)