組織工程牙髓再生的研究進展

王冠華

天津市口腔醫院暨南開大學口腔醫院中心實驗室　300041

組織工程牙髓再生的研究進展

王冠華

天津市口腔醫院暨南開大學口腔醫院中心實驗室300041

摘要齲病、牙髓病是普遍危害人類健康的疾病，目前臨床主要采用樹脂充填或根管治療方法。盡管上述治療方法均能一定程度的恢復牙齒解剖形態及功能，但是無法替代有正常功能的牙髓組織，導致牙齒失去營養容易變脆劈裂，最終造成牙齒的缺失。隨著組織工程技術的廣泛應用，組織工程牙髓再生逐漸得到發展和重視。本文系統回顧了牙髓組織工程研究進展，包括種子細胞、生長因子及用于牙髓組織工程的常用支架材料等內容。

關鍵詞組織工程牙髓干細胞牙髓再生

齲病是人類發病率最高的疾病之一，如果未得到有效的治療，就會發展為牙髓病以及根尖周疾病。目前對于牙髓和根尖周疾病主要的治療方法是根管治療。雖然根管充填材料具有良好的生物相容性，但是依然無法替代有正常功能的牙髓組織，無法對牙齒起到滋養、修復等作用[1]。失去牙髓的牙齒更容易發生再感染和牙齒劈裂，從而進一步造成牙齒缺失[2]，因此，需要有新的治療手段避免牙齒的喪失。隨著組織工程技術的廣泛應用，牙髓再生成為新的治療手段，它能夠替代損傷的牙髓組織行使功能[3]。

1種子細胞

干細胞是一類具有自我復制和多向分化潛能的細胞，它在不同環境的作用種子細胞、理想的支架材料以及相應的生長因子是牙髓組織工程現代理念中的三大關鍵要素[4]，本文就上述關鍵因素進行介紹。牙髓干細胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)是一種存在于牙髓組織中的成體干細胞，由Gronthos 首次提出，主要是從牙髓細胞中分離得到的間充質干細胞[1]。Gronthos 利用酶消化法，從健康的人第三磨牙牙髓中分離得到牙髓干細胞[5]，它的免疫表型與間充質干細胞相似。牙髓干細胞的形態類似人骨髓成纖維細胞，大多數細胞呈長梭形，體積較小[6]。而乳牙牙髓干細胞是分離培養自脫落乳牙的干細胞[7]，其形態呈多形性，大部分呈梭形，體積較小，輪廓清楚[8]，由此可見成人牙髓干細胞與乳牙牙髓干細胞形態有很多相似之處。

牙髓干細胞具有多種生物學特性。Couble 等將從健康人牙髓中分離提取的牙髓細胞中加入磷酸甘油進行誘導分化后形成復合體，這些細胞還能夠分泌富含Ⅰ型膠原的基質并礦化[9]，這些都能證實了牙髓干細胞具有成牙本質分化能力。有文章指出牙髓干細胞的表面標記物與間充質干細胞相似，包括Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146和CD166等的表達都與間充質干細胞相似[10]。另外它作為干細胞同樣具有多向分化潛能，在培養過程中添加一定的誘導劑后，具有向成骨、神經、肌肉、脂肪等細胞分化的能力。同時，體外培養的牙髓干細胞比骨髓間充質干細胞具有更高的克隆形成能力，它的增殖速度是骨髓間充質干細胞的30～50倍[11]。這些都充分說明了牙髓干細胞作為組織工程種子細胞具有很多優越性，因此它在牙髓組織工程再生中具有良好的應用前景。乳牙牙髓干細胞作為干細胞也同樣具有成骨、神經、肌肉、脂肪等細胞分化的能力[12]。研究還證實乳牙牙髓干細胞在陽性表達和多向分化性方面與牙髓干細胞相似，如成骨性和成脂性[13]。另外有文章指出流式細胞儀檢測顯示乳牙牙髓干細胞CD29、CD73和CD146呈陽性表達[14]。這在很大程度上說明了牙髓干細胞和乳牙牙髓干細胞具有很多相同的生物學特性，它們均能作為種子細胞用于牙髓組織工程再生。但從組織來源上看，與成人牙髓干細胞相比，脫落乳牙來源容易而且無創傷，且組織來源更加年輕，細胞活性更加良好。因此它更加適合作為組織工程牙髓再生的種子細胞。

牙髓干細胞和乳牙牙髓干細胞的分離方法比較簡單，目前通常應用組織塊法和酶消化法獲得牙髓干細胞和脫落乳牙干細胞。采用免疫磁珠分選系統分離得到干細胞，具體原理是通過應用包被抗小鼠IgM MicroBeads的免疫磁珠，將牙髓干細胞的磁性標記分選柱移出磁場后，洗脫滯留柱內的細胞，從而獲得牙髓干細胞[15]。由于乳牙牙髓干細胞與成人牙髓干細胞具有很多相似的生物學特性因此可以采用相同的方法得到脫落乳牙的牙髓干細胞。另外也可以應用流式細胞儀進行干細胞的分選，但相較于免疫磁珠分選系統，流式細胞儀分選得到的干細胞量相對較少。

2生長因子

信號因子的主要作用是誘導干細胞分化，目前促干細胞生長的信號因子主要是骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMP)、轉化生長因子(Transforming growth factor,TGF-β)、堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)以及白細胞介素等。作為干細胞中的一種牙髓干細胞同樣也受到信號因子的影響。有學者向牙髓干細胞中轉入BMP-7基因，并在無礦化誘導的情況下進行細胞培養，結果證明加入人類BMP-7基因的牙髓干細胞有向成牙本質細胞分化的能力和較強的硬組織形成能力[16]。另外也有文章指出基因重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子G-CSF能夠促進牙髓干細胞進行牙髓重建[17]。b-FGF是成纖維細胞生長因子家族中的一員,在體外能刺激細胞增殖、遷移，且對細胞有絲分裂和增殖具有較強促進作用，同時也能夠參與調控組織血管化、組織損傷修復等。有研究報道顯示b-FGF可以明顯促進牙髓干細胞的體外擴增速率、克隆形成能力及細胞遷移能力[16]，充分說明了在牙髓干細胞增殖和分化的過程中BMP和b-FGF都起到了非常重要的作用。另外巨噬細胞集落刺激因子G-CSF也對牙髓干細胞增殖具有促進作用，在進行牙髓干細胞培養和牙髓組織工程再生的過程中可以適當添加相應的生長因子，促進細胞生長和組織再生。另外還有一些其他的細胞因子對牙髓干細胞增殖有影響，如早期炎癥相關細胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosisfactor-α，TNF-α)、白細胞介素(IL-1β、IL-6、IL-10)等都對牙髓干細胞的增殖分化有一定的影響。有學者從炎癥牙髓中檢測出TNF-α高表達，證實其直接參與并加重牙髓炎的進展。也有研究發現TNF-α可以促進牙髓干細胞向成牙細胞分化[16]。目前關于牙髓干細胞生物學性能影響因素的研究很多，有很多生長因子都參與到牙髓干細胞的增殖和分化的過程中，這需要進一步的研究探討尋找更適合DPSCs生長的環境。

3支架材料

作為組織工程牙髓的三大關鍵要素之一，支架材料在牙髓再生中也發揮著非常重要的作用。隨著口腔組織工程再生的逐漸發展，應用于口腔組織的工程材料也隨之發展。作為支架材料需要具有以下基本特點：無毒性，任何組織工程材料應用的最終目的都是植入人體，因此不能有毒性；有良好的生物相容性，不能引起周圍組織發生嚴重的炎性反應而影響細胞增殖；可降解性，植入機體內的支架材料應能被周圍組織吸收而其降解率宜與再生組織的形成速率保持一致；有合適的孔隙率，以利于細胞生長并傳遞營養和代謝產物等[18]?？傊M織工程支架材料都必須符合人體的生長環境，以便其在功能上能夠代替正常的人體組織。

目前應用于牙髓組織工程的材料包括聚乳酸、聚羥基乙酸和二者共聚物、藻酸鹽、膠原、羥基磷灰石、磷酸三鈣、自組裝多肽等。國內有學者將殼聚糖與磷酸三鈣組合成一種新的三維多孔結構復合材料, 使其具有良好的機械強度及韌性,且磷酸三鈣降解產物呈堿性能夠中和殼聚糖所產生的酸性物質,因此能夠減輕炎癥反應[19]。李景輝等將牙髓細胞與明膠材料復合培養并植入裸鼠體內4周后，有骨組織形成[20]。另外，血小板自身含有生長因子，目前富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)已經是非常重要的組織工程材料。PRP臨床上廣泛用于促進骨組織再生、創傷修復、牙周組織再生以及牙種植體骨愈合等多個領域[21]。隨著對PRP研究的不斷深入，它的應用也越來越廣泛，國內有學者將小型豬的牙髓細胞與提取的不同濃度的PRP進行復合培養，結果顯示10% PRP凝膠具有良好的可塑性以及富含生長因子的特性[22]。劉中寧等將PRP和第4代DPSCs復合激活后，植入雌性裸鼠背部皮下， 4周、8周后觀察到裸鼠皮下有白色生成物，單獨植入DPCs或PRP組未見生成物[23]。由此可見PRP作為牙髓組織工程的材料具有良好的應用前景，PRP不僅對牙髓細胞的增殖有促進作用，而且來源容易，可以應用患者本人外周血進行分離提取，從而降低了植入后的不良反應和組織排異。文軍等將改良的PRP按照不同濃度加入到培養的牙髓細胞中，2%改良富血小板血漿可以促進乳牙牙髓干細胞的增殖[24]，這在PRP濃度選擇上給了我們一些啟示?？傊?，上述相關研究都為PRP作為牙髓組織工程材料的研究奠定了工作基礎，且由于PRP其自身的特點其進一步應用于臨床也有很大的希望。

雖然，目前臨床治療牙體牙髓疾病的手段不斷更新，但仍然無法治療所有的疾病，有很多患者最終仍然喪失了牙齒。組織工程牙髓再生為解決這一難題提供了新的思路，但由于組織工程牙髓再生還處于發展階段，因此仍然有很多需要解決的問題，包括如何獲取穩定可靠的種子細胞，如何選擇和研發適合組織工程牙髓的支架材料以及促進細胞增殖的生長因子的研究等。但隨著組織工程學科的逐步發展，上述問題都能夠得到解決，因此組織工程牙髓再生在治療牙體牙髓疾病的應用中將會有良好的前景。

參考文獻

[1]龐欣.組織工程牙髓再生的研究進展〔J〕.口腔醫學研究，2013,29(1):1086-1088.

[2]Zhu X,Zhang C,Huang GT,etal.Transplantation of Dental Pulp Stem Cells and Platelet-rich Plasma for Pulp Regeneration〔J〕.Journal of Endodontics,2012,38(12)：1604-1609.

[3]雷港.牙髓再生的研究進展〔J〕. 國際口腔醫學雜志，2011,38(3)：292-296.

[4]熊華翠.組織工程牙髓的研究進展〔J〕. 廣東牙病防治,2013,21(1):50-54.

[5]王潔，劉加強，房兵.牙髓干細胞在組織工程中的研究進展〔J〕. 口腔頜面修復學雜志,2012，14(3)：183-186.

[6]韋曦.牙髓干細胞與牙本質再生相關性的研究進展〔J〕. 國外醫學口腔醫學分冊,2006，3(3)：169-171.

[7]Jeon M, Song JS, Choi BJ,etal.In vitro and in vivo characteristics of stem cells from human exfoliated deciduous teeth obtained by enzymatic disaggregation and outgrowth〔J〕.Archives of Oral Biology,2014,11(10)：1013-1023.

[8]王立媛,劉大勇,賈智.人脫落乳牙干細胞骨向分化相關分子Runx2的動態表達〔J〕.中國組織工程研究,2014，4(18)：2345.

[9]榮靖，周向榮，劉秋英，等.牙髓干細胞的研究進展〔J〕.生命科學,2010,22(10)：1031-1034.

[10]Nobuyuki Kawashima.Characterisation of dental pulp stem cells: A new horizon for tissue regeneration〔J〕.Archives of Oral Biology，2012，11(11)：1439-1458.

[11]李景輝，張方明，張振庭. 人恒牙牙髓干細胞分化為脂肪細胞的體外實驗研究〔J〕. 北京口腔醫學，2012,20(3)：142-146.

[12]Yu S,Diao S,Wang J，etal.Comparative Analysis of Proliferation and Differentiation Potentials of Stem Cells from Inflamed Pulp of Deciduous Teeth and Stem Cells from Exfoliated Deciduous Teeth〔J〕.Biomed Research International,2014，11(22)：1-12.

[13]Vishwanath VR, Nadig RR, Nadig R,etal.Differentiation of isolated and characterized human dental pulp stem cells and stem cells from human exfoliated deciduous teeth: An in vitro study〔J〕.J Conserv Dent，2013，9(5)：423-428.

[14]Martacic' JD,Francuski J,Luzajic' T,etal.Characterization of deciduous teeth stem cells isolated from crown dental pulp〔J〕.Vojnosanit Pregl，2014,71(8)：735-741.

[15]李景輝,張方明,張振庭.人恒牙牙髓干細胞體外定向誘導分化為成骨細胞的研究〔J〕.北京口腔醫學，2011,19(3)：139.

[16]王燕萍，曹靈,于金華，等.牙髓干細胞生物學性能影響因素的研究進展〔J〕.口腔生物醫學,2013, 4(3)：145.

[17]Nakashima M,Iohara K.Mobilized Dental Pulp Stem Cells for Pulp Regeneration:Initiation of Clinical Trial〔J〕. J Endod，2014,40(4 Suppl):S26-32.

[18]雷鳴，高麗娜.牙髓組織工程和再生中生物支架材料的進展〔J〕.牙體牙髓牙周病學雜志,2013,23(1):51-56.

[19]李珊，樊明文，梁素霞.成人牙髓干細胞與殼聚糖-磷酸三鈣復合材料相容性試驗研究〔J〕.腔醫學研究,2006,22(3)：264.

[20]李景輝，劉大勇，等.應用人恒牙牙髓干細胞與明膠支架構建組織工程骨的研究〔J〕.北京口腔醫學,2013,21(1)：21.

[21]李洪濤，段建民，片山直.富血小板血漿與洗滌血小板對人牙髓細胞礦化的作用〔J〕.中國組織工程研究,2012，16(7)：1206-1210.

[22]黃楊.牙本質基質-富血小板血漿凝膠構建牙髓組織工程支架的初步硏究〔D〕.廣西：廣西醫科大學,2009.

[23]劉中寧，姜婷，王衣祥.富血小板血漿促進人牙髓細胞的體內礦化潛能〔J〕.北京大學學報,2011,43(2)：276-279.

[24]文軍，吳補領，段建民,等.改良富血小板血漿促進乳牙牙髓干細胞增殖的最佳濃度〔J〕.中國組織工程研究,2014,18(28)：4517-4523.

(編輯落落)

◎致作者◎

統計學符號的書寫

收稿日期2015-05-20

中圖分類號：R783

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)20-2750-03