人克羅恩氏病與奶中副結核菌—人類關注的熱點

鞏紅霞　鞏強

摘要：副結核分枝桿菌能引起反芻動物的慢性腸炎，并有學者提出它也是引發人克羅恩氏病的病原體，但其傳播途徑目前仍然不是十分明確，然而有些證據卻表明人感染此菌是因為食入了污染副結核分枝桿菌的牛奶而遭受感染的，就目前而言，巴氏滅菌是否可以有效的殺滅污染奶樣中的菌體，仍是未知數。我們以前已經做過在牛奶中添加副結核菌，通過高溫短時的巴氏滅菌（72℃，15s）處理后，發現已經檢測不到菌的存在。但是副結核菌是細胞內的病原體，在巨噬細胞中存活，并且呈叢狀生長。估計在奶中可以躲避殺滅而殘存下來。最近一篇關于愛爾蘭的零售奶樣本的報道指出副結核菌已成功的從奶樣本中培養成活。

關鍵詞：副結核菌；Johne's??；牛奶；巴氏滅菌

1895年Johne和Frothingham首次報道了牛副結核菌，他們從嚴重感染腸炎的牛腸道中，成功分離出抗酸染色的細菌，接著證明它是引發反芻動物肉芽腫腸炎的病原體，副結核菌臨床表現為極其復雜的無法治愈的腹瀉、漸進性消瘦并最終死亡。發病時，腸道變皺增厚，不能正常的吸收營養。牛感染途徑是通過母體子宮及接觸和吸食了副結核菌污染的糞便和奶，但直到3～5歲時才有臨床癥狀，應激反應如分娩、哺乳或寄生蟲可以加速臨床癥狀的出現。副結核病引起的經濟損失也是巨大的，如在美國有20～40%的奶牛受到感染，有亞臨床癥狀的牛會增加乳腺炎的發生導致產奶量下降。并且本病無特效藥進行治療，唯一減少損失的方法是通過臨床進行淘汰和凈化。

1副結核菌引發的爭議

1.1副結核菌對人類的影響 副結核菌是否是人類的病原菌仍處于爭議階段，但有大量的資料表明，人的克羅恩氏患者中確實分離到副結核菌的存在。而目前感染此菌的奶和肉制品是否存在潛在的危害也不太清楚，本篇討論的主題是：存在于奶中的副結核菌對消費者有危害嗎？巴氏滅菌后副結核菌能殘存下來嗎？副結核菌是人克羅恩氏病的病原嗎？首先證實第一個問題：存在于臨床癥狀和亞臨床癥狀的牛糞便和奶中的副結核菌濃度很低（5～8CFU/50mL的奶），此外有副結核菌的奶也僅發生于個體動物，在加工廠，從許多農場收集到的奶要混在一起，這就進一步稀釋了副結核菌的濃度。在1996年，美國一家實驗室承擔了國家動物健康監測任務：牛奶監測，即關于美國副結核病在牛場傳播的綜合性研究，在血清學分析的基礎上，69個牛場通過血清學分析檢測到副結核菌陽性，他們每隔2w收集一次罐裝奶樣本，持續6w。船運冷凍送達實驗室培養和PCR分析，在培養12w后，發現沒有副結核活菌存在，并且PCR檢測也為陰性。得出的結論是：奶中的副結核菌已被稀釋到兩種方法均檢測不到的濃度。但是奶牛場中，糞便中有大量副結核菌污染奶而使菌殘留下來，仍是一個值得關注的熱點問題。從克羅恩氏患者的腸組織中檢測到的分枝桿菌有：偶發分枝桿菌病、多胞內分枝桿菌、龜分枝桿菌病和堪薩斯分枝桿菌病，同時也分離培養出副結核分枝桿菌，并通過PCR和DNA序列鑒別出來。

1.2克羅恩氏病的確診 因為克羅恩氏病的臨床癥狀與副結核病的晚期癥狀類似，所以有研究者提出副結核菌可能是引發本病的罪魁禍首，有兩篇文章描寫了從克羅恩氏患者的腸組織中發現了特異的副結核菌的DNA序列，但大部分的研究卻表明在克羅恩氏患者中并未檢測到副結核菌?？肆_恩氏病和副結核菌的潛在的聯系，對奶牛場來說已經成為一個不可回避的問題。自從1994年美國報道了在零售巴氏滅菌奶中培養出副結核菌的研究后，表明巴氏滅菌奶后殘存的副結核菌會緩慢的生長，但是副結核菌在65℃30min和72℃15s加熱處理后，副結核菌能否殘存下來的研究結論是高度有爭議。因為副結核菌是一個潛在的動物傳染病的病原體及它與克羅恩氏病的聯系特性，原奶中副結核菌滅活所需的最佳時間和溫度條件的研究是目前的熱點項目。

2實驗研究

2.1巴氏滅菌奶的評估 接下來的工作是去評估兩種巴氏滅菌奶即標準方法（63.5℃30min）和高溫短時（HTST）殺滅副結核菌的效果，在這個研究中接種了104或107CFU/mL的副結核菌，然后進行上述的處理，對兩種方法來說，副結核菌的數量都明顯的減少，然而，在每一系列的試驗中，奶中仍有殘留的副結核菌存活下來。其中一個原因可能是實驗時熱穿透力不夠，因為HTST巴氏滅菌奶是模擬商業滅菌的加熱和冷卻的條件，熱交換是通過循環水加熱到特定溫度并且熱處理過程中奶處于靜止狀態，但商業性的巴氏滅菌奶有系列的管路和盤子，奶在熱處理時會有很大的流速，熱穿透非常均勻一致。在將奶經過HTST巴氏滅菌后發現奶中仍含有10～103CFU/mL菌體，無論是用固體還是液體培養基都能在最初添加的102～103CFU/mL經72℃15s加熱后檢出活菌，但是在10CFU/mL 或CFU/50mL的奶中卻沒有分離到活菌，研究結論是如果奶中的菌數量高于102CFU/mL就有可能存活下來，但低于10CFU/mL通過HTST就可滅活。

另一個實驗進一步比較了原有的方法（65℃30min）和HTST（72℃15s），在奶中添加高濃度（104、106、108CFU/mL）副結核菌，并將變化的溫度和時間相結合，結果是，在水浴震蕩中浸入一個聚乙烯的小導管，放在65、72、74、76℃下30min，0～30min后仍有活菌存活，這個結果與Grant et al 用帶有瓶塞的玻璃管模擬原有的方法結果是一致的。相對來說72℃15s的處理能夠有效的殺死副結核菌，因為試驗設計巴氏滅菌是模擬氣流通過的商業巴氏滅菌奶技術。奶流通過一系列的不銹鋼快速加熱或冷卻產品，管道是彎曲的。兩個不同方法的結論是：氣流加熱奶對充分殺滅污染奶中副結核菌至關重要。

2.2副結核菌復活狀態 副結核菌自然屬性是呈叢狀生長，一般很少以單個菌落的方式存在，所以在巴氏滅菌中對叢狀細菌的殺滅是不夠的，并且副結核菌是一個細胞內的病原體，在宿主的巨噬細胞中生存，所以在巴氏滅菌的處理過程中可能會因其在細胞內生長而受到保護，有人從未感染副結核菌的牛中提取牛乳腺炎巨噬細胞后，加入副結核菌，然后加到原奶中，進行實驗室巴氏滅菌72℃15s后不能培養出副結核菌。這就與以前的實驗報告相互矛盾。在這項研究中所模擬的巴氏滅菌的實驗室方法也提供了原奶中副結核菌滅活的可靠性評估結果。研究結果表明：原有的方法是能夠充分殺滅副結核菌的，因為模擬HTST巴氏滅菌與現有的使用標準是不一致的。標準的HTST方法是加工車間必須有成套的不銹鋼盤，并有二次生產區、加熱區和冷卻區，此外與器具連接成一體的彎曲管的尺寸是一定的，在加熱時，奶通過管道能產生強大的氣流。

加熱后奶中殘留的副結核菌能否復活也是人們所關注的另一個焦點問題，許多的實驗室用HEYM培養基進行活菌計數，有兩個實驗室報道應用BACTEC液體培養基是比固體培養基更為敏感，我們也嘗試應用液體培養的方法去培養奶中的副結核菌，但均以失敗告終，因為奶中的其他雜菌生長速度過快，從而干擾了副結核菌的生長。有實驗室也研究了一些凈化步驟，如在培養集中加入抗生素來抑制其他雜菌的生長的方法。目前已經有更好的從奶中分離副結核菌的新方法，這個方法就是免疫磁珠法：即在磁珠上包被副結核菌的多克隆抗體來富集副結核菌，通過DNA提取及PCR的檢測，免疫磁珠最大能結合105CFU/mL，最小可結合10CFU/mL副結核菌，這個方法比目前的培養法要敏感10倍。

3討論

奶中副結核菌已成為公眾關注的熱點問題，考慮到有真菌和非抗酸性細菌的影響，美國一家實驗室應用免疫磁珠-PCR法已成功的從30份原奶和31份巴氏滅菌奶中檢測到10株和6株副結核菌。然而由于收集的樣本量多達1000多份，至少要花費18個月的時間來完成下一步的任務，所以進一步的培養活菌仍然沒有結果。

美國農業部始終將這一問題列入重點的監測項目，為保障人民生命安全，我們國家也應在這方面加大監測力度，同時研究人員也應進一步提高奶中副結核菌敏感性的檢測，同時還應與當地的農場一道研究和評估從患病牛、加熱奶以及初乳中副結核菌污染原奶的程度，得出的數據將有助于副結核病的預防、控制和傳播，從而減少不必要的經濟損失和降低人畜共患病的發生。

參考文獻：

[1]Chiodini， R. J. Historical overview and current approaches in determining a mycobacterial etiology of Crohn's disease， p. 1-15. In C. J. J.Mulder and G. N. J. Tytgat （ed.）， Is Crohn's disease a mycobacterial disease？ Kluwer Academic Publishers， Dordrecht[J].The Netherlands，2002.

[2]Chiodini， R. J.， and J. Hermon-Taylor.The thermal resistance of Mycobacterium paratuberculosis in raw milk under conditions simulating pasteurization[J].J. Vet. Diagn. Invest. 1993，5：629-631.

[3]Merkal， R. S.， and J. A. Crawford. Heat inactivation of Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare complex organisms in aqueous suspension[J].Appl. Environ. Microbiol，1979，38：827-830.

[4]Sanderson， J. D.， M. T. Moss， M. L. V. Tizard， et al. Mycobacterium paratuberculosis DNA in Crohn's disease tissue[J].Gut，1992，33：890-896.

[5]Streeter， R. N.， G. F. Hoffsis， S. Bech-Nielson， et al.Isolation of Mycobacterium paratuberculosis from colostrum and milk of subclinically infected cows[J].Am. J. Vet. Res，1995，56：1322-1324.

[6]Gitnick， G.， J. Collins， B. Beaman， D. et al. Preliminary report on isolation of mycobacteria from patients with Crohn's disease[J].Dig. Dis. Sci，1989，34：925-932.

[7]Thompson， D. E.The role of mycobacteria in Crohn's disease[J].J. Med. Microbiol，1994，41：74-94.

[8]Dell'Isola， B.， C. Poyart， O. Goulet， J. F. Mougenot， E. ，et alDetection of Mycobacterium paratuberculosis by polymerase chain reaction in children with Crohn's disease[J].J. Infect. Dis，194， 169：449-451.

編輯/申磊