白樺脂酸聯合沙利度胺誘導U266 細胞凋亡機制研究*

孫 嘉，馬 丹，王 萍，方 琴

(1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院 血液科，貴州 貴陽 550004;3.貴州醫科大學附屬白云醫院 藥劑科，貴州貴陽 550014)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是目前一種仍不能治愈的以漿細胞惡性增殖為特征的疾?。?］，臨床上多采用環磷酰胺、沙利度胺等藥物誘導化療［2－3］。白樺脂酸(betulinic acid，BA)是從白樺樹樹皮中提取的一種天然化合物，有抑菌、調血脂及抗瘧疾等藥理活性［4－5］。研究表明，白樺脂酸作用于腦瘤、骨髓瘤等惡性淋巴腫瘤細胞后，對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用［6］。近年來，開發毒副作用低、能長期性和西藥合用治療MM 中藥已成為研究的新熱點［7］。本課題主要以MM 為切入點，以MM 的U266 細胞為研究對象，探討白樺脂酸聯合沙利度胺促進U266 細胞凋亡及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人MMU266 細胞房獲贈于湘雅醫學院附屬第二醫院血科。白樺脂酸購自Alexis 公司，沙利度胺購自美國Sigma life secience 公司，RPMI-1640 培養基和胎牛血清均購自Gibco 公司，β-actin、Survivin、Bcl-2、Bax、Cyto-c 單克隆抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT 購自美國AxyPrep 公司，Prime-ScriptTMRT reagent KIT 購自日本TaKaRa 公司，SYBR Premix Ex TapTM實時熒光定量PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U266 細胞接種于含15%的RPMI-1640 培養基中，于5%CO2，37 ℃的培養箱中培養，隔天換液，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.2.2 試劑溶液的配制 用電子天平精密分別稱取白樺脂酸和沙利度胺，分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中配制成5 g/L 原液，分裝備用，4 ℃保存。實驗時分別用含血清RPMI-1640 培養基逐級稀釋即得各給藥濃度。

1.2.3 U266 細胞增殖抑制率 U266 細胞株按5×103個/孔接種于96/板，在37 ℃，5%CO2條件下培養，用白樺脂酸(20、40、60 和80 mg/L)、沙利度胺(10、50 和100 mg/L)及白樺脂酸(40 mg/L)聯合沙利度胺(10、50 和100 mg/L)分別處理，分別為白樺脂酸組、沙利度胺組和聯合組，每種濃度設5個復孔，同時設對照組(不做任何處理)，置37 ℃、CO2體積分數為5%的飽和濕度培養箱分別培養適宜時間(白樺脂酸組24、48 和72 h，沙利度胺組和聯合組48 h)，然后每孔加入MTT 溶液(5 g/L)10 μL，繼續溫育4 h，終止培養，棄孔內上清液，每孔加入DMSO150 μL，震蕩10 min，使結晶充分溶解，并用酶聯免疫檢測儀在490 nm 波長處檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(對照組A 值－實驗組A 值)/對照組A 值×100%。根據增殖抑制率和濃度計算出IC50值，IC50=lg－1［Xm－i(ΣP－0.5)］，求得最適濃度。

1.2.4 流式細胞術法檢測細胞凋亡率 取對數生長期U266 細胞4×104/mL，接種于6 孔板，每孔接種量2.5 mL，分別用沙利度胺(10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L)或與白樺脂酸聯合處理48 h，用PBS 洗滌細胞1 次，1 500 r/min 離心5min，調整細胞濃度為1×106，制備的單細胞懸液用70%乙醇固定，4 ℃保存;染色前用PBS 洗去固定液，加RNase A100 μL 于37 ℃水浴30 min。加入PI 染色液400 μL 混勻，4 ℃避光30 min，上流式細胞儀檢測U266 細胞凋亡情況。

1.2.5 U266 中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA檢測 分別取對照組、白樺脂酸(40 mg/L)、沙利度胺(50 mg/L)以及聯合組(40 mg/L 白樺脂酸聯合50mg/L 沙利度胺)U266 細胞，用AxyPrep Multisource Genomic RNA Miniprep KIT 試劑盒提取細胞總RNA;按PrimeScriptTMRT reagent KIT 和SYBR Premix Ex TapTM實時熒光定量PCR 試劑盒說明書分別進行cDNA 的合成和RT-PCR 反應。Survivin上游引物5'-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3'，下游引物5'-AGCCACTCCCCCACAGC A-3'。Bcl-2 上游引物5'-TGTGCCTGTAAACATAGATTGGC-3，下游引物5'-CTTCCAGACATCGCACACCA-3'。Bax 上游引物5'-CCAAGAAGAAGCTGAGCGAGTCTC-3'，下游引物5'-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3'。Cyto-C 上游引物5'-GCCCGGAACGAATTAAAAAT-3'，下游引物5'-TGCCTCCCTTTTCCACAGT-3'。β-actin 上游引物5'-GACAAGGGCTCCGGCATGTG-3，下游引物5'-TGAGGATGCCTCTCTTGCTC-3'。

1.2.6 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白檢測 分別取對照組、白樺脂酸(40 mg/L)組、沙利度胺(50 mg/L)及聯合組(40 mg/L 白樺脂酸聯合50 mg/L沙利度胺)U266 細胞，加入細胞裂解液的樣本冰上孵育30 min，超聲粉碎儀進行超聲粉碎。4 ℃12 000 r/min 離心20 min，取少量以Bradford法測定蛋白濃度。取25 μg 蛋白經12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉移至PVDF 膜上，PVDF 膜經封閉液室溫封阻1 h，加入一抗4 ℃搖床過夜，用辣根過氧化物酶標記的二抗檢測蛋白表達。β-actin 作為內參，Western blotting 檢測Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白的表達。

1.3 統計學方法

所得數據采用SPSS 17.0 統計軟件處理，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度白樺脂酸對U266 細胞的增殖抑制率的影響

U266 細胞經白樺脂酸處理24、48 和72 h 后，在相同時間下，隨著作用濃度的增加，白樺脂酸U266 細胞增殖抑制率增加，差異有統計學意義(P ＜0.05);白樺脂酸對U266 細胞的IC50值24、48、72 h 分別為((76.27±1.83)mg/L、(42.81±2.18)mg/L、(29.64±2.53)mg/L。根據IC50得出，白樺脂酸作用于多發性骨髓瘤U266 細胞最適濃度為40 mg/L。見圖1。

2.2 沙利度胺組與聯合組對U266 細胞增殖抑制率的影響

圖1 不同濃度白樺脂酸對U266 細胞增殖抑制率的影響(MTT)Fig.1 The effect of BA at different concentrations on proliferation inhibition rate of U266 cells

與沙利度胺組相比，聯合組U266 細胞的增殖抑制率明顯升高(P ＜0.05);隨著沙利度胺濃度增加，兩組U266 細胞的增殖抑制率均明顯升高(P ＜0.05);沙利度胺組和聯合組的IC50值分別為(52.02±2.34)mg/L、(26.19±3.21)mg/L，聯合白樺脂酸用藥可以明顯抑制U266 細胞的增殖(P ＜0.05)。根據IC50值得出，沙利度胺作用U266細胞最適濃度為50 mg/L。見圖2。

圖2 沙利度胺組與聯合組中U266 細胞增殖抑制率(MTT)Fig.2 The effects of halidomide single or combined with betulinic acid on proliferation inhibition rate of U266 cells

2.3 沙利度胺組與聯合組對U266 細胞凋亡的影響

用沙利度胺、沙利度胺聯合白樺脂酸分別處理U266 細胞48 h，與沙利度胺組比較，聯合組U266細胞的凋亡率更高，差異具有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

2.4 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA 的表達

與沙利度胺組或白樺脂酸組相比，聯合組U266 細胞中Survivin、Bcl-2 mRNA 的表達明顯降低，Cyto-C 和Bax mRNA 表達明顯升高，差異具有統計學意義(P ＜0.05)。見圖3。

表1 沙利度胺組與聯合組U266 細胞的凋亡率(%)Tab.1 The apoptosis rate of U266 cells in thalidomide group and combination group

圖3 4 組U266 細胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax mRNA 的表達Fig.3 Expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA of U266 cells in the 4 groups

2.5 Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白質水平

與沙利度胺、白樺脂酸組相比，聯合組U266細胞中Survivin、Bcl-2 蛋白表達明顯降低，Cyto-C和Bax 蛋白表達明顯升高，差異具有統計學意義(P ＜0.05)。見圖4。

3 討論

多發性骨髓瘤是骨髓漿細胞惡性疾病，主要以骨髓中漿細胞惡性增殖并引起相關器官或組織損害為表現［8］。多發性骨髓瘤患者一般常常伴有高鈣血癥，貧血，腎功能嚴重損傷等多種并發癥，由于多發性骨髓瘤能抑制人體正常免疫球蛋白的增殖而導致各種細菌性感染頻發［9］。臨床研究表明，臨床治療多發性骨髓瘤得化療方案多以硼替佐米或來那度胺聯合馬法蘭等藥物治療［10－13］，但化療存在藥物耐受性差、不良反應多等缺點而不能達到很好的治療效果。目前，多發性骨髓瘤仍難治、易復發［14－17］。

本實驗探討白樺脂酸聯合沙利度胺是否可以促進多發性骨髓瘤U266 細胞凋亡，采用不同濃度的白樺脂酸處理多發性骨髓瘤U266 細胞，白樺脂酸可以抑制U266 細胞的增殖，并隨著白樺脂酸濃度的升高，增殖抑制率升高，說明白樺脂酸在多發性骨髓瘤細胞中發揮了重要作用，白樺脂酸可以促進U266 細胞凋亡，進而使多發性骨髓瘤疾病有所改善。本實驗還將白樺脂酸聯合沙利度胺共同作用于多發性骨髓瘤U266 細胞，觀察細胞增殖抑制率及凋亡率，與單獨用藥相比，聯合用藥可明顯抑制U266 細胞增殖，并促進其凋亡，提示白樺脂酸與沙利度胺聯合用藥可用于治療多發性骨髓瘤可以起到一定效果，可以成為今后臨床研究的一個新靶點。

凋亡的調控是細胞生理死亡和腫瘤發生的重要的發生機制，一些凋亡調控因子在多發性骨髓瘤疾病中發揮了重要作用。本研究檢測U266 細胞中凋亡家族相關基因和蛋白，發現如果白樺脂酸聯合沙利度胺共同處理多發性骨髓瘤U266 細胞之后，Survivin、Bcl-2 的表達與單獨用白樺脂酸或沙利度胺顯著降低，白樺脂酸聯合沙利度胺可明顯下調Survivin、Bcl-2 表達，而激活Cyto-c、Bax 表達，從而促進腫瘤細胞凋亡，為多發性骨髓瘤的臨床研究提供了新的實驗依據。

綜上所述，本研究結果顯示，白樺脂酸聯合沙利度胺用藥可以抑制骨髓瘤U266 細胞的生長，并促進其凋亡，聯合用藥可能成為臨床治療多發性骨髓瘤的信策略。然而，在未來的研究中，我們將需要更多的體內實驗以探討聯合應用白樺脂酸的有效性和對多發性骨髓瘤治療的作用機制。

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圖4 4 組U266 細胞中Survivin、Cyto-C、Bcl-2、Bax 蛋白的表達Fig.4 Expression levels of Survivin，Cyto-C，Bcl-2，Bax mRNA of U266 cells in the 4 groups

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