鴨肝炎病毒基因CRT-PCR快速檢測型和A型一步法雙重方法的建立和應用

李天芝 于新友 王金良 ( 山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 56600 山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 56600)

鴨病毒性肝炎 (duckviralhepatitis，DVH)是由鴨肝炎病毒(duckhepatitisvirus，DHV)引起的一種急性、高度致死性傳染病。臨床上病死雛鴨主要表現為角弓反張，病理剖檢以肝臟水腫，有針頭大至黃豆粒大出血點為特征。主要危害1～3周齡雛鴨，死亡率高達90%～95%[1]，給養鴨業帶來巨大的經濟損失[2、3]。該病于1945年首次在美國發現，隨后相繼在世界多數國家報道了該病的流行。最初將DHV分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種血清型，其中Ⅱ型DHV(DHV-Ⅱ)和Ⅲ型 DHV(DHV-Ⅲ)均屬于星狀病毒科，I型（DHV-Ⅰ）屬于小RNA病毒科，目前國內流行的DVH主要是由小RNA病毒科的成員引起的[4]，有學者建議根據基因結構將小RNA病毒科DHV分為基因A型(DHV-A)、B型(DHV-B)、C型(DHV-C)，分別對應原有的DHV-Ⅰ、從中國臺灣分離的新型鴨病毒性肝炎 (newtypeduckhepatitis virus，N-DHV)、從韓國和中國大陸分離的N-DHV[5]。為調查我國DHAV-C和DHAV-A流行情況，同時減少2個基因型檢測的工作量，本文根據GenBank上已發表的DHAV-C和DHAV-A的基因序列，分別設計了2對能特異性擴增引物，建立了可同時檢測DHAV-C和DHAV-A的一步法二重RT-PCR方法，為這2種基因型病毒快速檢測和流行病學調查等提供了有效的技術支持。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

基因C型鴨肝炎病毒（DHV-C）、基因A型鴨肝炎病毒（DHV-A）、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒由山東省濱州畜牧獸醫研究院預防獸醫學與動物生物技術重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2014年7月至2015年7月采自山東省各地鴨場臨床診斷為DHV感染的鴨肝臟等。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內切酶、PCR相關試劑、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒為愛思進生物技術(杭州)有限公司產品。

1.3 RT-PCR引物設計與合成

用PrimerPremier5.0基因分析軟件，參照GenBank中登錄的DHV-C基因序列（DQ256134）設計1對引物，擴增DHV-C目的基因片段大小為270bp，引物序列如下：DHV-CF：5′ -GCGTCTAAGTCTTAATGGATT-3′，DHV-CR：5′-CGGGCACTCATGTTAT-GGAC-3′。參照GenBank中登錄的DHV-A基因序列（DQ864514）設計1對引物,擴增DHV-A目的基因片段大小為479bp，引物序列如下：DHV-AF：5′-GCAGACTACCAAGGTTGT-3′ ，DHV-AR：5′ -ACCCACTGTCCTGTAACC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取DHV-C和DHV-A的RNA，并提取其他幾種參照病毒的核酸。

1.5 一步法雙重RT-PCR擴增及條件優化

最適退火溫度的確定：分 別 以 48℃ 、50℃ 、52℃ 、54℃、56℃、58℃、60℃的退火溫度進行梯度一步法雙重RT-PCR反應，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。

最適引物濃度的確立：在25μLPCR反應體系中分別加入各對引物,使引物濃度分別為0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物濃度，篩選出一步法雙重RT-PCR反應體系的最佳反應模式。

1.6 特異性試驗

分別提取DHV-C、DHV-A、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒的核酸，用已建立的一步法雙重RT-PCR方法進行擴增。

1.7 敏感性試驗

分別提取DHV-C、DHV-A的RNA后定量，分別作10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，每個稀釋度取lμL為模板，采用已優化的一步法雙重RT-PCR反應條件分別對上述不同稀釋度的RNA進行一步法雙重RT-PCR擴增，反應結束后進行凝膠電泳檢測，以檢測建立的一步法雙重RT-PCR的敏感性。

1.8 重復性試驗

用建立的一步法雙重RT-PCR檢測方法分別對DHV-C感染的8份陽性樣品，DHV-A感染5份陽性樣品及3份陰性樣品重復檢測3次，以驗證本方法的重復性和穩定性。

1.9 臨床樣品的檢測

取DHV疑似送檢病料68份，利用建立的一步法雙重RT-PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 反應條件的優化

通過對DHV-C、DHV-A兩種引物濃度及一步法雙重RT-PCR擴增溫度、時間和循環次數等的優化，最后確定一步法雙重RT-PCR中最佳引物濃度分別為DHV-C 0.6μmol/L、DHV-A0.6μmol/L。一步法雙重RT-PCR的最佳反應模式為：50℃30min，95℃ 5min，94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，35個循環，最后72℃延伸10min。

2.2 擴增產物的檢測

將DHV-C和DHV-A的核酸分別進行一步法雙重RT-PCR擴增，結果能擴增出與試驗設計相符、DHV-C270bp、DHV-A479bp的特異性片段，而對照擴增不出任何條帶（圖1）。

2.3 特異性試驗

用建立的一步法雙重RT-PCR方法對DHV-C與 DHV-A混合樣品、DHV-C、DHV-A、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒在相同的條件下進行擴增。結果顯示，DHV-C和DHV-A的RT-PCR產物的片段長度分別為265bp和479bp，與預期大小一致，而鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒均未擴增出片段(圖2)，說明本研究建立的一步法雙重RT-PCR方法特異性強。

圖1 單項一步法RT-PCR擴增結果

2.4 敏感性試驗

用紫外分光光度計測定的模板RNA濃度，依次做10倍梯度稀釋，每個稀釋度取1μL作為模板。結果顯示用10pg的DHV-C和10pg的DHV-A作為模板該一步法雙重RT-PCR仍然可以擴增出特異性條帶（圖3）。

2.5 重復性試驗

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

經過3次重復操作，結果一致，表明本研究建立的一步法雙重RT-PCR方法是穩定可靠的。

2.6 臨床樣品的檢測

對68份在山東省不同地區采集的DHV疑似病料，用建立的一步法雙重RT-PCR和單項一步法RT-PCR進行了檢測，兩者符合率達100%，檢出DHV-C陽性樣品28份，DHV-A陽性樣品11份。

3 討論

參照GenBank中登錄的DHV-C基因序列（DQ256134） 和 DHV-A基因序列（DQ864514），利用PrimerPremier5.0分別設計1對引物，通過一步法RT-PCR擴增出目的基因，分別連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結果與模板序列進行比對，其同源性均為100%，本試驗確定的一步法雙重RT-PCR中最適引物濃度分別為DHV-C 0.6μmol/L、DHV-A0.6μmol/L時，達到最佳反應效果。反復優化多重PCR的反應參數，尤其要注意PCR反應的退火溫度要足夠高，因為一步法雙重RT-PCR反應體系中有多對引物，退火溫度過低往往會導致非特異性擴增產物出現，提高退火溫度則可有效減少非特異性擴增產物的生成，通過反復摸索條件，所確定的一步法雙重RT-PCR中最適退火溫度為54℃。特異性試驗結果顯示，本試驗所建立的一步法雙重RT-PCR檢測DHV-C、DHV-A的方法分別能夠擴增出270bp和479bp片段，而對常見的鴨源病毒，如鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨H9亞型禽流感病毒和鴨副黏病毒均無擴增產物，證明本方法具有較好的特異性。敏感性試驗結果顯示，對DHV-C、DHV-A的檢測靈敏度均可以達到10pgRNA。

通過對68份DHV疑似病料檢測結果顯示，單項一步法RT-PCR與一步法雙重RT-PCR檢測方法結果的符合率為100%?？梢栽谝环輼悠分型瑫r檢測出DHV-C和DHV-A2種病原體，達到對DHV-C和DHV-A的同步診斷，比單項擴增減少65%的時間和1/2的試劑，該法敏感性高、特異性強、快速簡便、檢測成本低，適合基層獸醫工作者使用。本研究為國內DHV-C和DHV-A的鑒別診斷和流行病學調查等提供了一種簡單、快速的分子生物學診斷方法。

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