金銀花SSR指紋圖譜的構建及遺傳多樣性分析

徐石勇　李歐靜　張舒瑋　鄧慧　劉征輝　王永　蘭青闊

摘 要：以金銀花及其常見變種為材料，利用SSR標記技術構建分子指紋圖譜，并用于遺傳多樣性分析。選擇25個SSR位點用于多態性分析，其中3個位點具有較強多態性，并構建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，包括3對引物在6個供試材料中擴增到的18條多態性條帶信息。應用該指紋圖譜對金銀花及其變種的遺傳多樣性進行分析，結果表明，金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠，僅0.28。應用該指紋圖譜對87個市售金銀花進行分析，能夠區分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。SSR標記技術具有快速、穩定的優點，具備金銀花種質資源標準化分析及中藥材市場化檢測應用的價值。

關鍵詞：金銀花；SSR標記；指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號：Q946 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.05.003

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱的功效，為常用大宗中藥材?，F代醫學研究表明金銀花中含有木犀草黃素、肌醇、皂甙、綠原酸，糖類、蛋白質、維生素、多種化合物及多種微量元素，一些常用藥如銀翹解毒丸、清開靈、銀黃片等均以金銀花為主要原料。隨著我國對金銀花開發利用的突破性進展，其在茶飲、日化、化妝品和保健品等領域的需求急劇增大。為滿足市場需求，我國近年來大面積種植金銀花藥材，但在種質資源鑒定及遺傳多樣性分析方面還沒有一套標準化的方法。

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR），也稱微衛星DNA，是一類由幾個（一般為1～5個）核苷酸為重復單位組成的核苷酸串聯重復序列。SSR標記具有多態性豐富、重復性好、共顯性、分布廣等優點，常用于蔬菜遺傳育種[1]、基因定位[2]、遺傳圖譜構建[3]、種質鑒定等。玉米[4]、小麥[5]、棉花[6]等主要農作物已建立成熟的基于SSR標記的種子鑒定技術標準及配套的指紋圖譜。本研究以金銀花及其常見變種為材料，應用SSR分子標記技術建立指紋圖譜，并對河北、山東、河南金銀花樣品的遺傳多樣性進行分析，為促進金銀花藥材鑒定標準化與品種選育提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、金銀花、金銀花4倍體等標準品（依次編號為S1～S6，表1），以及購自山東、河南的87個市售金銀花樣品，由天津海世達檢測技術有限公司提供，研磨后用于DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

參照Murray&Thompson[7]方法，做適當改良后用于金銀花基因組DNA提取。DNA濃度用NanoDrop-1000 spectrophotometer（Thermo）檢測并稀釋至50 ng·μL-1，-20 ℃保存備用。

1.3 SSR位點信息與引物

從GenBank數據庫查詢金銀花核酸序列369條，使用BatchPrimer3在線軟件掃描分[8]獲得32個候選SSR位點，并設計SSR-PCR引物。并結合文獻查閱，確定25對引物（表2）用于多態性分析。

1.4 SSR-PCR分析

PCR反應采用10 μL體系：其中2×GoTaq Green Master Mix（Promega）5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，DNA模板0.5 μL（50 ng·μL-1），滅菌去離子水補足至10 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min；35個循環反應（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72℃ 30 s）；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR儀為ABI veriti 96 well Thermol cycler。聚丙烯酰胺凝電泳：膠濃度為8%，電壓250 V，電泳1 h；采用銀染法進行顯色。

1.5 數據分析

凝膠顯色后置于凝膠成像系統拍照，使用GeneTools（Sygene）軟件對電泳圖譜中穩定且易分辨的條帶進行分子量分析；聚類分析使用SLT-NTSYS（2.10）軟件。

2 結果與分析

2.1 金銀花SSR位點多態性檢測

以6份材料DNA為模板，對25對SSR引物進行PCR擴增及聚丙烯酰胺凝膠電泳。篩選結果發現，25對引物中4對無擴增條帶，有13對引物擴增出的條帶大于1條，說明該13個SSR位點在6個材料中具有多態性。其中位點jp.ssr48、jp.ssr58和jp.ssr59多態性較高（圖1），適合于金銀花SSR分子指紋圖譜的構建。

2.2 金銀花SSR指紋圖譜構建

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，比較3個SSR位點在6份材料中的多態性。將每個樣品的特異性譜帶按照相互位置差異在相同遷移率位置上進行“1，0”標注，構建基于Excel格式的SSR指紋圖譜[9]。SSR指紋圖譜包含了6個材料3個SSR位點信息，共18個條帶，平均每對引物 6條（表3）。

2.3 金銀花SSR標記遺傳多樣性分析與應用

對6個樣品進行遺傳多樣性分析，結果表明6個材料分為2大類（圖2），大毛花及其4倍體為一類，灰氈毛忍冬、華南忍冬、紅腺忍冬、黃褐毛忍冬為另一類，山銀花與金銀花遺傳距離較遠，僅0.28。山銀花中灰氈毛忍冬、華南忍冬遺傳距離最近，其次為紅腺忍冬，再次為黃褐毛忍冬。

使用上述3對SSR引物，對購自河北省巨鹿縣、山東省平邑縣、河南省封丘縣的87個金銀花樣品進行PCR-SSR檢測及聚類分析。結果表明，三產地的樣品與山銀花的遺傳距離較遠，全部為金銀花樣品；但又可分為兩類，其中一類為來自河北省巨鹿縣的50個樣品和來自河南省封丘縣的6個樣品，其一致性很強，表明兩地金銀花品種的親緣關系很近；來自山東省平邑縣的8個樣品被歸于另一類，但又細分為5小類。

3 結論與討論

來源純正、品質優良的藥用植物資源是中藥現代化和標準化生產的重要前提。金銀花是我國常用大宗中藥材，亟需對其開展遺傳多樣性分析并建立標準化的種質資源鑒定方法。自2007年以來，我國科學家應用RAPD[10]、RFLP[11-12]、同工酶[13]、ISSR[14-15]、DNA Barcoding[16]等標記技術對金銀花及其變種進行遺傳多樣性分析，取得了顯著的效果。但上述標記技術也存在著重現性差、樣品用量大、周期長、操作復雜等缺陷，未能實現標準化。SSR標記具有鑒別力高、開發成本低、操作相對自動化、不受環境影響等優點，被普遍認為是最接近于理想化的品種鑒定技術[17-20]。隨著測序技術和生物信息學技術的發展，通過網絡可以免費獲得海量的EST等序列信息及具有SSR掃描及引物設計功能的生物軟件，這為EST-SSR標記的開發提供經濟、便利的條件。

蔣超等[21]對忍冬及其變種紅白忍冬的EST序列進行生物信息學分析，初步了解其SSR多態性特點，并通過試驗證明了SSR標記可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。本研究通過對2種金銀花及其4種山銀花偽品進行SSR標記位點探索開發，構建小規模的指紋圖譜，并初步應用于金銀花種植資源遺傳多樣性分析及種質鑒定分析。結果表明，SSR標記技術具有快速、穩定的優點，具備金銀花種質資源標準化分析及中藥材市場化檢測應用的價值。但本研究存在樣本基數小、篩選位點少等問題，需要進一步從全國范圍內擴大種質資源的搜集，開展大規模的EST-SSR位點篩選。

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