應用實時熒光定量PCR檢測血清miR-122和miR-22及其在慢性乙型肝炎患者中的表達

姜躍煒 葉 瑾 朱小區

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應用實時熒光定量PCR檢測血清miR-122和miR-22及其在慢性乙型肝炎患者中的表達

姜躍煒 葉 瑾 朱小區

目的 建立血清中microRNA(miRNA)的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的檢測方法，對慢性乙型肝炎患者血清中miR-122和miR-22的表達水平進行檢測和分析，探討其在慢性乙型肝炎患者血清中表達的意義。方法 莖環引物用于成熟型miRNA反轉錄，以建立SYBR Green Ⅰ PCR篩選和定量檢測miRNA的方法。同時，采用10倍梯度稀釋的miR-122標準品cDNA(1～109拷貝/微升)評價其敏感度；采用熔解曲線評價其檢測miRNA的特異性；通過對2×105、2×106、2×107拷貝/微升的miR-122標準品cDNA分別進行批內20次重復實驗，以其循環閾值(Ct)的變異系數(CV)評價其精密度。采用建立的qRT-PCR技術檢測慢性乙型肝炎患者及正常人血清中miR-122和miR-22的表達水平。結果 建立了莖環引物的RT-PCR法檢測血清中的miRNA，該方法的線性范圍寬，敏感度高，重復性好，方法簡便。在慢性乙型肝炎患者組中血清miR-122和miR-22的相對表達量分別為17.88和5.35；與正常對照組中血清miR-122和miR-22的相對表達量(分別為1.80和1.67)比較，差異有統計學意義(P均=0.000)。結論 建立了莖環引物RT-PCR實時熒光定量PCR方法檢測血清中的miR-122和miR-22，血清miR-122和miR-22在慢性乙型肝炎患者的血清中表達顯著升高。

miR-122 miR-22 慢性乙型肝炎

我國乙型肝炎病毒表面抗原攜帶者占全國人口的7.18%[1]。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是引起慢性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要原因。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守、長度20～24 個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，miRNA是一類在血清中穩定存在的短小核苷酸，已有報道證實miRNA可以作為肝臟損傷和妊娠的非常敏感的分子標志物[2,3]。 miR-122是肝細胞內特異高表達的miRNA。既往研究表明由miR-122, miR-22等11個miRNA組成的表達譜能預測干擾素治療慢性乙型肝炎患者的療效。但是檢測乙型肝炎患者血清中的miRNA尚缺乏商品化的試劑盒，筆者利用莖環引物優化試驗方法，建立SYBR Green PCR定量檢測miRNA，同時初步評價其檢測性能。并利用建立的方法檢測血清miR-122和miR-22在慢性乙型肝炎患者的血清中表達的意義。

材料與方法

1.研究對象：按照2010年中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病分會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]標準，篩檢來自溫州市中醫院2010年1月～2012年12月HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者43例為研究對象，除外其他病毒重疊感染。其中男性36例(83.72%)，女性7例(16.28%)，患者平均年齡29.31±5.58(19～41)歲。正常對照者40例，為筆者醫院保健科體檢結果正常的人群。其中，男性32例，女性8例，患者年齡26.22±6.23(20～44)歲。兩組年齡和性別差異無統計學意義(P>0.05)。

2.試劑及儀器:miRNA提取試劑(北京天根)；CDNA第1鏈合成試劑(美國Thermo)；SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒(日本TaRaKa)；ABI 7900HT Fast real-time 熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

3.實驗方法:(1)標本采集與處理:采集標本后2h 內用離心機離心12000g，4℃，15min，取上清，-80℃凍存。(2)血清miRNA富集部分的提?。河秒x心柱法提取血清miRNA富集部分。(3)合成cDNA：采用美國Thermo公司生產的Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，反應條件為：25℃ 5min；42℃ 60min；70℃ 5min 反應結束后，擴增好的cDNA模板用DNase-Free ddH2O稀釋10倍作為定量PCR的模板。(4)miRNA 的熒光定量檢測：采用TaRaKa 公司生產的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR試劑盒進行real-timePCR 檢測，所有反應采用2復孔。20μl的反應體系：2μl的cDNA，10μl的SYBR Green Ex Taq，3.6μl的RNase -free water，2μl的PCR Forward Prime, 2μl的PCR reverse prime,0.4μl的ROX Reference DyeⅡ，miR-122、miR-22及U6引物由蘇州金唯智公司合成，miR-122 引物序列為5′-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3′,miR-22 引物序列為5′-AAGCTGCCAGTTGAAGAACTGT-3′,U6引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′為：95℃30s，接著95℃5s，60℃34s，40 個循環。采用ABI 7900實時定量PCR儀進行檢測。(5)實驗結果數據處理:檢測miRNA的相對表達定量時，以U6作為內參基因,采用2-ΔΔCt法進行結果分析。以不同樣本的相對表達定量值進行比較。以Fold=2-ΔΔCt表示待測組血清中miR-22和miR-122相對于對照組中表達水平的表達倍數。其中ΔΔCt=待測標本的ΔCt-對照樣本ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

結 果

圖1 qRT-PCR檢測血清miRNA的條件優化1μmol/L濃度的莖環引物使PCR起跳點最明顯，熒光值變化最顯著；2μmol/L以上引物濃度使PCR基線增高，熒光曲線扁平，PCR擴增檢測效率減弱

圖2 miR-122擴增曲線圖及熔解曲線圖

圖3 miR-22擴增曲線圖及熔解曲線圖

圖4 將109拷貝/毫升 miR-122 cDNA標本稀釋后進行檢測從左至右為108、107、106、105、104、103拷貝/毫升 miR-122 cDNA擴增結果，僅在103拷貝/毫升時出現偏差

圖5 莖環引物RT-PCR法檢測miR-122的線性方程

2.在慢性乙型肝炎患者組中和正常對照組中血清miR-122和miR-22的表達：在所有的慢性乙型肝炎患者和正常對照則者中，血清miR-122和miR-22都被檢測到。以U6為內參，慢性乙型肝炎患者組中的血清miR-122和miR-22的相對表達量(Fold=2-ΔΔCt)都比正常對照組顯著升高，采用Mann-WhitneyU檢驗，兩者比較差異均有統計學意義(P均<0.001，表1，圖6)。

表1 兩組血清miR-122和miR-22的表達比較 M[(P25～P75)]

與正常對照組比較,P均<0.001

圖6 慢性乙型肝炎患者組和正常對照組中血清miR-122、miR-22的表達比較

討 論

研究表明一定數量的循環miRNA可作為癌癥檢測或藥物引起的肝損傷的一個穩定的標志物。作為起源于組織的在血清中的循環miRNA是復雜的[3]。肝臟損傷是由宿主免疫攻擊引起的，可能有助于乙型肝炎患者血清中miRNA的產生。Zhang等[5]在對慢性HBV感染者血清中的miRNA表達研究中發現，miR-122可作為不同肝損傷的標志物，并且具有良好的敏感度和特異性。Zhang等[6]通過94例接受干擾素治療的慢性乙型肝炎患者的血清樣本做基因芯片分析，發現包括miR-22在內的11個血清miRNA表達譜能較好地預測干擾素治療慢性乙型肝炎早期病毒學應答，有助于提高患者干擾素治療的依從性和療效。Hao等[7]發現IFN-α治療能導致miR-122在肝細胞中表達減少。所以筆者選擇了血清中miR-22和miR-122兩個miRNA作為我們的研究對象。在筆者的研究中，建立了莖環引物的實時熒光定量PCR法檢測血清中的miRNA。并進行了該方法的線性范圍和敏感度評估實驗與重復性實驗，結果表明該方法線性范圍寬，敏感度高，重復性好，方法簡便。用RT-PCR法檢測血清miR-122和miR-22的表達水平，慢性乙型肝炎患者組比正常對照組顯著升高。提示這兩個miRNA在HBV感染后表達上調。因此，血清中miR-122和miR-22的表達水平有可能作為乙型肝炎病毒感染的有效指標。

1 梁曉峰，陳園生，王曉軍，等．中國3歲以上人群乙型肝炎血清流行病學研究[J]．中華流行病學雜志，2005,26(9)：655-658

2 Gilad S,Meiri E,Yogev Y,etal.Serum microRNAs are promising novel biomarkers[J]．PLoS One 2008,3(9):e3148

3 Wang K,Zhang S,Marzolf B,etal.Circulating microRNAs,potential biomarkers for drug-induced liver injury[J]．Proc Natl Acad Sci USA 2009,106(11):4402-4407

4 中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].中華臨床感染病雜志,2011,4(1):1-13

5 Zhang Y, Jia Y, Zheng R,etal. Serum microRNA-122 as a biomarker for viral-, alcohol-, and chemical-related hepatic diseases[J]. Clin Chem，2010, 56(12): 1830-1838

6 Zhang X, Chen C, M Wu,etal.Serum microRNA profile as a predictor of early virological esponse to pegylated interferon treatment in chronic hepatitis B patients[J]. Antiviral Therapy, 2012,17(7): 1243-1253

7 Hao JL,Jin WS,Li XH,etal.Inhibition of alpha pegylated interferon(IFN-α)-induced microRNA-122 negatively affects the anti-hepatitis B virus efficiency of IFN-α[J].Journal of Virology，2013,87(1):137-146

(修回日期：2015-02-10)

Detection of Serum miR-122 and miR-22 in Patients with Chronic Hepatitis B by Using of a Quantitative Real-time PCR.

JiangYuewei,YeJin,ZhuXiaoqu.

TheTraditionalChineseMedicalHospitalofWenzhou,Zhejiang325000,China

Objective To establish a real-time quantitative PCR (RT-PCR) assay for detecting serum miR-122, miR-22, and evaluate the clinical significance of miR-122 and miR-22 in patients with chronic hepatitis B (CHB) by using of this assay. Methods The mature miRNAs were reversely transcripted by using of stem-loop primers. SYBR GreenⅠquantitative real-time PCR (qRT-PCR) was used for quantification of the miRNAs. The sensitivity of this assay was evaluated by using of the 10-fold-diluted miRNA-122 cDNA standards and the specificity was verified by using of melting curve assay. The accuracy was assessed by intra-assay coefficient of variation (CV) of threshold cycle (Ct value), which were calculated from a 20-times-repeat detection of the miR-122 cDNA (2×105, 2×106, 2×107copies/μl) standards. Using the established qRT-PCR assay, we detected the expression of serum miR-122 and miR-22 in the patients with CHB and healthy controls. Results The qRT-PCR assay exhibited good performances in the linear range, sensitivity and reproducibility while detecting miR-122 and miR-22. The relative level of miR-122 and miR-22 was 17.88 vs 5.35 in the CHB patients and 1.80 vs 1.67 in the controls (P=0.000). Conclusion Using of stem-loop primers, we established a qRT-PCR assay for detection of serum miR-122 and miR-22. Serum miR-122 and miR-22 increased significantly in the CHB patients.

miR-122;miR-22;Chronic hepatitis B

325000 溫州市中醫院檢驗科

R512

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.034

2015-01-29)