人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態的研究

江丹丹 郭敬強 陳 亮

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人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態的研究

江丹丹 郭敬強 陳 亮

目的 本實驗通過建立胰腺癌SW-1990細胞株皮下移植瘤模型，探討人參皂甙Rg3對胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態的影響。方法 首先建立人胰腺癌細胞裸鼠模型，后給予不同藥物濃度的人參皂甙Rg3(0、5、10、20mg/kg)處理裸鼠，觀察人參皂甙Rg3對裸鼠移植瘤生長的影響，免疫組化-PAS雙染觀察人參皂甙Rg3對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤血管生成擬態和血管內皮因子CD31的影響，并用熒光定量PCR和Western blot法分別檢測MMP-2、MMP-9在mRNA和蛋白水平的表達。結果人參皂甙Rg3能夠抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長，其中20mg/kg人參皂甙Rg3組最明顯；Western blot法和熒光定量PCR示用藥組與空白組比較，MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達下降，且差異有統計學意義(P<0.05)；免疫組化-PAS雙染后發現血管擬生(+)和CD31(+)數量均較空白組減少。結論 通過體內實驗筆者證實人參皂甙Rg3能夠通過降低MMP-2、MMP-9的表達來抑制胰腺癌血管生成擬態的形成。

胰腺癌 胰腺癌裸鼠皮下移植瘤 血管生成擬態 基質金屬蛋白酶

胰腺癌是一種惡性程度非常高的消化道腫瘤，由于其起病隱匿，臨床發現時大部分已處于晚期，治療上手術切除是目前主要的治療方式，但由于術后易復發，其5年的生存率僅為20%[1]。腫瘤的生長主要依靠新生血管的形成，傳統觀念認為新生血管的形成大都起源于血管內皮細胞。然而Maniotis等[2]發現在人眼葡萄膜黑色素瘤中存在一種由細胞外基質和黑色瘤細胞包繞組成的，在電子微鏡下觀察到在管腔中存在紅細胞而無內皮細胞的互相連接的環袢狀網絡結構，通常將這種不依賴于內皮細胞的腫瘤內血管生成狀態稱為血管生成擬態，隨后人們陸續在其他腫瘤中同樣證實這種血管生成擬態的存在。有臨床報道，胰腺癌中存在血管生成擬態，但是其形成具體機制仍不清楚。

人參皂甙Rg3是從人參中提取的一種微量四環三萜皂甙，其能夠通過多種機制發揮抗腫瘤作用[3～7]。筆者前期實驗研究發現胰腺癌SW-1990細胞株在體外三維培養環境中能形成血管生成擬態，人參皂甙Rg3能夠使MMP-2、MMP-9的表達下降，抑制胰腺癌SW-1990細胞株在三維培養環境中血管生成擬態的生成，但體外三維培養環境與體內的差異較大，對實驗結果會造成影響。本實驗通過建立胰腺癌SW-1990細胞株裸鼠皮下移植瘤模型，探討人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態的影響。

材料與方法

1.試劑:人參皂甙Rg3標準品(純度≥98%)，購買于美國Sigma公司,DMEM培養液、胰酶購于Gibco公司，MMP-9、MMP-2抗體購買于Abcam公司。

2.細胞培養和胰腺癌動物模型的建立:胰腺癌細胞株SW-1990購買于美國ATCC公司，培養于DMEM培養液中，置于37℃、飽和濕度含5%C02及95%氧氣的孵箱中培養。動物實驗經過嘉興學院醫學院倫理文員會批準。BALB-/C-nu裸鼠28只,18～22g，4～6周齡,購自中科院上海實驗動物中心,飼養于嘉興學院醫學院實驗動物中心(SPF級),有關動物的實驗操作均按規定進行。動物模型的建立：待SW-1990細胞培養至鋪滿瓶底70%～80%時，用胰酶消化貼壁細胞,用含DMEM和血清1∶1的液體稀釋成2×106/100μl的單細胞溶液，在無菌條件下于裸鼠背側近右后肢處皮下接種100微升/只。當癌細胞接種后3天，把裸鼠隨機分成4組，每組7只，之后通過腹腔注射給予不同人參皂甙Rg3濃度處理(0、5、10、20mg/kg)，隔日1次，共給藥4周，最后一次給藥后3天處死裸鼠，取移植瘤組織用于后續實驗研究。

3.免疫組化-PAS雙染：上述留取的裸鼠移植瘤組織，經4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，經3%的雙氧水滅活過氧化物酶20min，1×PBS洗滌3次，每次5min，后經5%的山羊血清室溫下封閉20min，一抗CD31(1∶100)4℃過夜孵育，PBS洗滌后經辣根標記的山羊抗鼠二抗(1∶100)37℃孵育1h。DAB復染8min，高碘酸作用10min，然后置于Schiff液中，目測組織出現紫紅質后流水沖洗終止。蘇木素復染2min，流水沖洗12min，分化、反藍、常規脫水、透明、樹膠封片。CD31/PAS陽性結果判定及量化方法如下[8]：400×高倍顯微鏡下隨機選取10個視野，腫瘤細胞彼此融合，連接成網絡結構且PAS陽性的為形成擬生態血管；腫瘤組織中出現CD31陽性、PAS染色陰性的為血管內皮依賴的管道，CD31陰性、PAS染色陽性且管腔內發現紅細胞者為擬生態血管，以平均數來計算兩者的量。

4.熒光定量PCR檢測MMP-2、MMP-9 mRNA的表達:根據說明用TRIzol一步法提取裸鼠移植瘤組織中總的RNA，按RNA反轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA，cDNA用DEPC水稀釋3倍。MMP-2、MMP-9和內參GAPDH的引物用1×TBE Buffer 稀釋成10pmol/ml待用，其引物序列見表1。將擴增好的cDNA，待用的稀釋引物，熒光PCR水，SYRB Green按照SYRB Green 5μl、上游下游引物各1μl、cDNA 1μl、余下用熒光PCR水補足配成10μl的反應體系，上機(Roche)擴增45個循環。結果用Light Cycler 480軟件分析。

表1 引物序列和擴增產物長度 ±s)

5.Western blot法檢測MMP-2、MMP-9蛋白水平的表達：裸鼠移植瘤組織獲取后立即放入加有液氮的研缽中碾磨，提取移植瘤組織的蛋白，之后用BAC試劑盒測定蛋白的濃度，配體系。制好10%的膠板后，蛋白60μg濃度上樣電泳，恒流300mA 轉膜，1×TBS平衡5min，后5%的脫脂牛奶封閉2h，一抗(MMP-9 1∶1000，MMP-2 1∶100)4℃過夜，二抗(1∶5000) 室溫下2h，1×TBST洗滌后，加ECL 化學發光曝光，結果用AlphaEaseFC 4.0軟件分析。

結 果

1.人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響: 與不用藥組比較，人參皂甙Rg3可以抑制裸鼠胰腺癌皮下移植瘤的生長，并且隨著用藥濃度的增加，移植瘤的形成有逐漸變小的趨勢，其中10mg/kg和20mg/kg濃度人參皂甙Rg3作用最明顯。裸鼠麻醉后取瘤稱重，測量瘤體長和寬，按照(4/3)π[(長度+ 寬度)/4][9]計算瘤體的體積，各組瘤體重量和體積的量化差別見表2所示。

圖1 不同濃度的人參皂甙Rg3(0、5、10、20mg/kg)分別作用于裸鼠皮下移植瘤4周后，對胰腺癌皮下移植瘤的影響A.0mg/kg;B.5mg/kg;C.10mg/kg;D.20mg/kg;由圖A、B、C、D可以看出，隨著藥物濃度的升高，移植瘤的形成有逐漸變小的趨勢

表2 不同濃度的人參皂甙Rg3對裸鼠皮下移植瘤重量和體積影響的量化

2.人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態的影響：單純CD31染色，可見一抗CD31將具有血管內皮結構的血管部分染成棕黃色(圖2A)；單純PAS染色，將血管擬態區管道壁及細胞外基質染成紫紅色(圖2B)；圖2C所示在PAS(+)的通道中能夠見到腫瘤細胞，說明腫瘤細胞可以經過血管生成擬態發生轉移；圖2D所示CD31染色(+)的管道和PAS(+)的通道相連，說明血管生成擬態和內皮依賴性血管相通，血管生成擬態同樣可以給腫瘤組織的生長、侵襲、復發和轉移提供基礎；空白組和用藥組的雙染結果分別如圖2E、F、G、H所示，隨著人參皂甙Rg3的用藥，血管擬生態的形成能力逐漸下降，CD31/PAS陽性量逐漸下降，其具體數值如表3所示。

3.Western blot法和FQ-PCR檢測各組裸鼠移植瘤組織MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達：如圖3A所示，隨著人參皂甙Rg3用藥濃度的增加，與不用藥組比較，移植瘤組織的MMP-2、MMP-9蛋白的表達逐漸下降；其中20mg/kg組下降最明顯，差異有統計學意義(P<0.05) ；與Western blot法的結果相對應的熒光定量PCR結果如圖3B所示，隨著人參皂甙Rg3用藥濃度的增加，與不用藥組比較，移植瘤組織的MMP-2、MMP-9在mRNA水平表達均下降，其中20mg/kg組下降最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 采用免疫組化-PAS雙染法觀察人參皂甙Rg3對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤血管生成擬態的影響

表3 裸鼠CD31/PAS陽性量化計數具體數值

圖3 采用Western blot法和FQ-PCR分別檢測不同用藥濃度的人參皂甙Rg3對MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表達的影響與對照組比較，P<0.05

討 論

傳統觀念認為腫瘤血管的形成主要依靠內皮細胞，據研究發現在黑色素瘤中存在一種由腫瘤細胞自身和細胞外基質形成的能夠運輸紅細胞的管型通道，即血管生成擬態[2]。血管生成擬態一般出現在高度惡性的腫瘤組織中，是腫瘤細胞形成的新型血管網絡結構[5]。正如本實驗證實，在胰腺癌裸鼠移植瘤組織中存在血管生成擬態，血管可以形成花環狀結構，其為腫瘤的生成和侵襲提供營養基礎，隨著人參皂甙Rg3的用藥，裸鼠移植瘤組織形成血管擬生態的能力逐漸下降，主要表現在免疫組化-PAS雙染中CD31(+)和PAS(+)陽性數量逐漸下降。

基質金屬蛋白酶(MMP)是一組鋅依賴性內肽酶，與腫瘤浸潤和轉移等密切相關。據Seftor等[10]報道在高侵襲性黑色素瘤組織中 MMP2、MMP9的表達較其他腫瘤組織中明顯增加，使腫瘤細胞結合更多的層黏連蛋白，最終促進血管生成擬態的形成。研究發現人參皂甙Rg3抑制MMP-2、MMP-9的表達而發揮抗腫瘤作用[11]。正如本研究所證實，在裸鼠移植瘤組織中，MMP2、MMP9呈高表達狀態，隨著人參皂甙Rg3的用藥，與不用藥組比較MMP-2、MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達均下降。故通過本實驗筆者推測人參皂甙Rg3抑制胰腺癌皮下移植瘤的生長和其可抑制MMP2、MMP9的表達有關，并進一步抑制血管生成擬態的形成。

總之，血管生成擬態的提出是對經典的內皮依賴性腫瘤血管的補充，為部分臨床腫瘤抗血管治療效果不佳提供一合理的解釋。通過體內實驗筆者證實人參皂甙Rg3能夠通過降低MMP-2、MMP-9的表達來抑制胰腺癌血管生成擬態的形成，該發現可能為臨床治療工作提供幫助。

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(修回日期：2015-01-06)

Effects of Ginsenosides Rg3 on Vasculogenic Mimicry of Pancreatic Cancer Xenograft.

JiangDandan,GuoJingqiang，ChenLiang.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstHospitalofJiaxing,Zhejiang314000,China

Objective To investigate the effects of ginsenosides Rg3 on vasculogenic mimicry of pancreatic cancer xenograft through the establishment of pancreatic cancer cell line SW-1990 subcutaneous xenograft model. Methods After pancreatic cancer xenograft in nude mice model beening established, All the mice were randomly divided into 4 groups and treated intraperitoneally (IP) with saline and various concentrations (5,10,20 mg/kg) of ginsenosides Rg3. To observe the effect of ginsenoside Rg3 on tumor growth. Immunohistochemical-PAS staining was used to detect the effects of ginsenosides Rg3 on vasculogenic mimicry of pancreatic cancer xenograft. and mRNA and protein expression of MMP2、MMP9 were respectively evaluated by FQ-PCR and Western blot. Results The ginsenosides Rg3 can inhibit the growth of the tumor xenografts in nude mice. The inhibitory effect is the most obvious the 20 mg/kg of ginsenosides Rg3 group. The expression of MMP-2, MMP-9 were down-regulated compare with the control group, and the difference was significant; the Immunohistochemical-PAS staining showed the number of vasculogenic mimicry (+) and CD31 (+) were less than that in the control group. Conlusion Our results demonstrate that pancreatic vascular mimicry formation can be suppressed by Ginsenoside Rg3 though reducing the expression of MMP-2, MMP-9 in our vivo experiments,

Pancreatic cancer; Xenograft model of pancreatic cancer; Vasculogenic mimicry; Matrix metalloproteinase

314000 嘉興市第一醫院(江丹丹、陳亮)；310012 麗水市中心醫院(郭敬強)

R6

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.035

2014-12-13)