抑郁模型大鼠不同部位miR-16表達及其與5-羥色胺轉運體的關聯性研究

宋明芬 王玉文 董介正 章 隆 施劍飛 張永華

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抑郁模型大鼠不同部位miR-16表達及其與5-羥色胺轉運體的關聯性研究

宋明芬 王玉文 董介正 章 隆 施劍飛 張永華

目的 研究miR-16在慢性不可預知溫和應激抑郁癥模型大鼠神經系統不同部位的表達及其與5-羥色胺(5-HT)轉運體的關聯性。方法 對照組和慢性不可預知溫和應激抑郁模型組大鼠各10只，模型組大鼠接受21天的不可預知溫和應激刺激，對照組大鼠正常飼養。兩組大鼠麻醉后收集腦脊液，測定miR-16。然后斷頭處死，分離前額葉皮質、中縫核、海馬，測定miR-16和5-HT轉運體蛋白。結果 模型組大鼠腦脊液和中縫核的miR-16相對表達量低于對照組，中縫核miR-16與5-HT胺轉運體呈負相關；而前額葉皮質和海馬中的miR-16、5-HT轉運體分別與對照組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。結論 中縫核miR-16可能通過調節5-HT轉運體的表達，參與抑郁癥的病理過程，腦脊液miR-16亦可能與抑郁癥相關。

慢性不可預知溫和應激抑郁模型 miR-16 5-HT轉運體

世界衛生組織公布，抑郁癥已成為世界第4大疾患，預計到2020年，可能成為僅次于冠心病的第2大疾病[1]。抑郁癥具有患病率高(終生患病率女性為10%～25%、男性為5%～12%)、復發率高(1年30%，5年70%)、自殺率高(10%～25%)等特點，是全球性公共衛生問題之一，給個人、家庭和社會帶來極大的精神損失和巨大的經濟負擔[2～4]。然而，其病因和發病機制尚未清楚，給該病的診斷和治療帶來極大困難。microRNAs(miRNAs)是近年來表觀遺傳學研究的熱點，是一類進化保守的、18～25個核苷酸的非編碼RNA分子，通過與靶基因的mRNA 3′非翻譯區(3′-untranslated region, UTR)結合，引起mRNA的降解或者翻譯的抑制，從而調節蛋白表達，在生物發育和疾病發生、發展中起重要作用[5, 6]?，F有的研究揭示，miR-16可能與抑郁癥相關，其參與抑郁癥的機制，可能是其在腦組織中以5-羥色胺(5-HT)轉運體(serotonin transporter, SERT)基因作為靶基因，參與SERT翻譯水平的調控，從而影響腦組織內5-HT神經遞質功能發揮[7, 8]。但至今尚未明確神經系統中的哪些部位參與抑郁癥的發病。本實驗通過建立大鼠慢性不可預知溫和應激抑郁模型，比較抑郁模型組和對照組miR-16在不同部位(腦脊液、前額葉皮質、海馬、中縫核)的差異，以及分析miR-16與SERT蛋白的相關性，旨在探明miR-16參與抑郁癥的作用部位及其機制，為弄清抑郁癥的發病機制以及尋找合適的生物學標志物提供參考。

材料與方法

1.實驗動物及分組：清潔級雌性SD大鼠20只，購自浙江省醫學科學院，實驗動物合格證號：SCXK(浙)2008-0033，體重約150g，隨機分成對照組(10只)和抑郁模型組(10只)。飼養室溫度23±1℃, 相對濕度55%±5%。

2.抑郁模型建立：慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)模型組大鼠每天隨機接受以下刺激中的1種：4℃冰水浴5min、禁水24h、晝夜跌倒、懸尾10min、45℃高溫5min、禁食48h、鼠籠傾斜24h、潮濕墊料24h、夾尾1min、束縛應激2h，連續3周。對照組大鼠每天12h明亮(8:00～20:00)、12h黑暗(20:00～8:00)，自由攝食飲水。

3.抑郁行為評定：采用糖水消耗實驗和曠場實驗評定抑郁樣行為。(1)糖水消耗實驗：造模前和造模后各1次，分3天完成，第1天將大鼠單籠飼養，給予2瓶1%的蔗糖水；第2天，將其中1瓶蔗糖水換成自來水，進行蔗糖水偏好訓練。第3天，大鼠禁水23h后，給予1瓶1%蔗糖水和1瓶自來水，計算1h內蔗糖水和自來水消耗量，進行糖水偏好率測定。糖水偏好率(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+自來水消耗量)×100%。(2)曠場實驗：長寬高分別100cm、100cm和60cm的容器，底部等分為面積相等的25格，內壁為黑色，容器正上方放置一個攝像頭，將單只大鼠放入中央，紀錄3min內的行走得分與垂直得分(行走得分：大鼠3只爪子進入1個格子計1分；垂直得分：大鼠前爪離地或攀附桶壁1次計1分)。曠場試驗固定在18：00～19：00時進行，安靜黑暗環境，并每次都清理大鼠排泄物，去除可能留下的味道。每只大鼠造模前與造模后共進行2次曠場試驗。

4.腦脊液、前額葉皮質、海馬、中縫核組織的取材：抑郁行為學指標測定后，在大鼠麻醉后，頭部固定于定向儀上。頭頸部剪毛、消毒，用手術刀沿縱軸切一縱行切口(約2cm)用剪刀鈍性分離頸部背側肌肉。為避免出血， 最深層附著在骨上的肌肉用手術刀背刮開，暴露出枕骨大孔，由枕骨大孔進針直接抽取腦脊液。斷頭處死大鼠，按包新民等的大鼠腦立體定位圖譜，在冰上迅速分離前額葉皮質、海馬和中縫核[9]。

5.Western blot法測定SERT蛋白：使用真核膜蛋白提取試劑盒Mem-PER Eukaryotic Membrane Protein Extraction Reagent Kit(Thermo Fisher Scientific公司, 美國)提取前額葉皮質、海馬、中縫核組織的膜蛋白，并且通過Bradford法對蛋白進行定量。Western blot法測定SERT蛋白的步驟按照Huff等[10]的文章進行?？筍ERT一抗 (1∶250稀釋)，抗β-actin一抗(1∶250稀釋)以及辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000稀釋)購自加拿大Santa Cruz公司。使用ChemiDocTM XRS+ (Bio-rad美國)系統自帶的軟件分析SERT蛋白條帶，并用β-actin進行校正。

6.實時熒光定量PCR法測定miR-16：通過miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取腦脊液、前額葉皮質、海馬、中縫核總RNA，用nanodrop(美國thermo scientific公司)測定其濃度及純度；取2μg RNA進行反轉錄，獲得的cDNA用于下一步的實時定量熒光PCR擴增。U6為內參校準基因，引物序列：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-3′，miR-16引物序列：5′-TAGCAGCACGTAAATTGGCG-3′。下游引物為通用引物[北京天根生化科技有限公司miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)自帶]。實時定量熒光PCR擴增程序為：預變性94℃ 2min；PCR反應：94℃ 20s，60℃ 34s，循環40次,實時PCR儀購自ABI公司stepone plus，使用儀器配套軟件自動對數據進行分析得到每個樣本的循環閾值(cycle threshold，Ct值)，并通過標準曲線法獲得每個樣本的miR-16含量，所得數據用對應的U6進行校正。

結 果

1.抑郁行為學指標結果:造模前，模型組的糖水消耗率、曠場實驗水平得分和垂直得分分別與對照組比較，差異無統計學意義(P值分別為0.872、0.835和0.602)；造模后，抑郁模型組大鼠糖水偏好率顯著低于對照組(P=0.032)，曠場實驗水平得分和垂直得分都明顯低于對照組(P=0.042和P=0.000，表1)。

表1 兩組大鼠糖水消耗實驗以及曠場實驗結果 ±s)

2.腦脊液、海馬、前額葉皮質、中縫核miR-16測定結果:模型組腦脊液中的miR-16相對表達量比對照組明顯降低，差異有統計學意義(t=3.049，P=0.007)；海馬中miR-16相對量在兩組間差異無統計學意義(t=0.169，P=0.868)。前額葉皮質miR-16的相對表達量，模型組與對照組之間的差異亦無統計學意義(t=0.280，P=0.782)。中縫核miR-16的相對表達量，模型組顯著低于對照組，差異有統計學意義(t=2.333，P=0.031，表2，圖1)。

表2 腦組織不同部位miR-16測定結果

圖1 腦脊液和中縫核miR-16熒光定量PCR測定結果A.腦脊液；B.海馬；C.前額葉皮質；D.中縫核

3.海馬、前額葉皮質、中縫核SERT蛋白測定結果:SERT蛋白的水平，海馬組織中，模型組與對照組比較，差異無統計學意義(t=0.243，P=0.811)；前額葉皮質中，模型組與對照組之間的差異均無統計學意義(t=0.762，P=0.456)。中縫核中，模型組顯著高于對照組，差異有統計學意義(t=3.184，P=0.005，圖2和表3)。

4.中縫核miR-16與SERT蛋白表達的關聯性:經相關分析，對照組和模型組中縫核miR-16與相應的SERT蛋白之間均存在明顯的負相關關系。對照組的相關系數為r=-0.662，P=0.037； 模型組的相關系數為r=-0.701，P=0.024，詳見圖3。

圖2 不同腦區SERT蛋白Western blot法檢測結果

表3 不同腦區SERT蛋白測定結果

圖3 中縫核miR-16與SERT蛋白的相關性A.對照組；B.模型組

討 論

本實驗通過建立慢性不可預知溫和應激大鼠抑郁模型，研究大鼠神經系統不同部位miR-16表達及其與SERT的關聯性，從而進一步明確miR-16在何部位參與抑郁癥的病理生理過程。在脊椎動物體內，腦組織中的miRNAs遠比其他組織豐富，提示miRNAs可能在腦功能的發揮中起著重要作用[11, 12]。有研究者發現，腦脊液中的miRNAs可能與精神疾病相關。比如2014年，Muller等[13]的研究表明，阿爾茨海默病患者腦脊液中的miR-146a比健康人低。但是迄今為止，尚未有抑郁癥腦脊液miR-16水平的報道。因此本實驗采集了抑郁模型大鼠的腦脊液，進行miR-16測定，結果發現其水平比對照組大鼠低。該結果有待進一步證實，以確定腦脊液miR-16作為抑郁癥生物學標志物的可行性。

本研究還對腦組織前額葉皮質、海馬、中縫核中的miR-16進行了測定。有研究者發現，抑郁癥自殺患者前額葉皮質中的某些miRNAs存在異常，如miR-494和miR-335比健康對照低[14]。但是，目前尚未發現抑郁癥前額葉皮質miR-16的報道，本次抑郁模型大鼠的前額葉皮質miR-16水平測定結果表明，模型組大鼠前額葉皮質miR-16水平與對照組比較，差異無統計學意義，而且該部位SERT蛋白的表達亦與對照組差異無統計學意義，表明，前額葉皮質miR-16可能不參與抑郁癥的病理過程。

近年來，海馬miR-16與抑郁癥的研究得到了一些研究者的關注。如張逸等[15]在母愛剝奪大鼠抑郁模型中，發現海馬miR-16比正常大鼠高，作者認為，海馬高miR-16參與了母愛剝奪誘發的大鼠抑郁樣行為的病理過程。在另外的一項研究中，抗抑郁藥氟西汀能降低小鼠海馬組織miR-16，如果使用人工合成的抗miR-16對miR-16進行中和，則抗miR-16表現出抗抑郁樣作用[16]。但是在Bai等的研究中，作者采用慢性不可預知溫和應激建立抑郁模型，未發現模型大鼠的海馬miR-16發生改變?；诤ｑRmiR-16在不同抑郁模型結果中的不一致性，以及Bai等[17]未比較海馬SERT蛋白的差異，因此本實驗在測定模型大鼠海馬miR-16的同時，也分析了海馬SERT的差異，結果表明，模型大鼠海馬miR-16并未升高，該結論與Bai等[17]發表的論文一致，而且該部位SERT蛋白的表達，與對照組比較，亦無統計學差異。以上結果表明，海馬miR-16未參與和慢性不可預知溫和應激抑郁相關的病理過程，提示不同的應激所誘發的大鼠抑郁行為，其機制可能不同。

中縫核因聚集5-HT能神經元，其主要功能是產生遞質5-HT，因而在miR-16與抑郁癥的關聯性研究中具有重要意義。Baudry 等將氟西汀(1μmol/L、2μl/min)直接緩慢注入中縫核3天，發現該區miR-16升高了2.5倍，SERT的表達降低了2倍；直接在該區注射miR-16(1μl、2μmol/L)也觀察到SERT表達的下降；然而，當氟西汀和抗miR-16一起注射的時候，SERT表達未受影響，由此可見，氟西汀是通過miR-16調節SERT蛋白的表達[7]。然而，在抑郁動物模型中，中縫核miR-16與對照的差異卻未被報道。本次實驗表明，慢性不可預知溫和應激抑郁模型大鼠中縫核miR-16低于對照組，其SERT蛋白水平卻高于對照組，且兩者間存在明顯的負相關關系。筆者認為，中縫核低miR-16狀態，可導致SERT蛋白過高表達，從而影響5-HT遞質系統的功能，從而參與慢性不可預知溫和應激造成的抑郁過程。

總之，本實驗通過測定神經系統不同部位miR-16水平，探討miR-16參與抑郁癥的可能部位及其機制。結果表明，慢性不可預知溫和應激抑郁模型大鼠腦脊液和中縫核miR-16存在異常，中縫核miR-16可能通過調節SERT蛋白表達而參與抑郁癥的發病過程。

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(修回日期：2015-02-23)

miR-16 Expression and Its Association with Serotonin Transporter in Multi-tissues of Depression Model Rats.

SongMingfen,WangYuwen,DongJiezheng,etal.

DepartmentofMolecularBiologicalLaboratory,HangzhouSeventhPeople′sHospital,Zhejiang310013,China

Objective To explore the expression of miR-16 and its association with serotonin transporter in multi-tissues from the rat model of chronic unpredictable mild stress-induced depression. Methods SD rats were randomly divided into the control group and the depression group. Rats in the depression group experienced unpredictable mild stressors for 3 weeks, while rats in the control group

no treatment. MiR-16 in cerebrospinal fluid, prefrontal cortex, hippocampus, and raphe was detected by real-time PCR. Serotonin transporter protein in prefrontal cortex, hippocampus, and raphe was detected by Western blotting. Results The relative expression levels of miR-16 in cerebrospinal fluid and raphe of the depression group were significantly lower than those of the control group. In raphe, the miR-16 level was negatively associated with expression of serotonin transporter protein. However, there was no significant difference of miR-16 expression in prefrontal cortex and hippocampus between the depression group and the control group. Conclusion MiR-16 in raphe may involve in the pathological process of depression via regulation of serotonin transporter expression. MiR-16 in cerebrospinal fluid may also associate with depression.

chronic unpredictable mild stress model of depression; miR-16; 5-HT serotonin transporter

浙江省自然科學基金資助項目(LQ13H090003)；杭州市科技發展計劃項目重點?？茖２】蒲泄リP專項基金資助項目(20130733Q26，20130733Q27)

310013 杭州市第七人民醫院分子生物學實驗室(宋明芬、章隆)，藥劑科(王玉文)，精神科(董介正、施劍飛、張永華)

張永華，主任中醫師，博士生導師，電子信箱: hzs7lwfb@163.com

R74

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.012

2015-01-28)