中期因子對骨折愈合過程微血管生成影響的實驗研究

李雄峰 李建有 周國順 管國華

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中期因子對骨折愈合過程微血管生成影響的實驗研究

李雄峰 李建有 周國順 管國華

目的 探討中期因子對骨折端微血管生成對骨折愈合的影響。方法 采用兔尺骨骨折模型，給以中期因子持續刺激骨折端7天為實驗組，給予生理鹽水刺激的為對照組，然后在21、42、63、84天，分別獲取標本。采用組織學Lane-sandhu評分分析骨組織的生成；免疫組化分析骨折端VEGF和CD34表達來探討骨折端的微血管生長情況，采用圖像分析和MVD評分進行統計分析。結果 組織學Lane-sandhu評分在42和63天實驗組明顯高于對照組，VEGF表達在42和63天實驗組明顯高于對照組；而CD34在42、63、84天周實驗組明顯高于對照組。結論 中期因子通過刺激骨折端微血管增生增加是骨折端骨痂生長加快的原因，有利于骨折愈合。

中期因子 骨折 微血管 血管內皮生長因子

隨著外傷骨折患者日益增多，骨折延遲愈合和不愈合的患者成為骨折治療的難題。骨折愈合過程中骨折端微血管的再生對骨愈合和骨重塑起著關鍵性的作用。中期因子(MK)具有較強的促進微血管生成作用。本試驗采用兔尺骨骨折模型局部使用MK刺激骨折端，探討MK對骨折端微血管生長和骨折的愈合情況的影響。

材料與方法

1.實驗動物:健康成年新西蘭大白兔64只，雌雄不限，體重2.0～3.0kg，由浙江大學實驗動物中心提供。實驗動物合格證號：2007A015。飼養在筆者醫院中心實驗室，實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

2.實驗試劑和儀器：CD34多克隆抗體(美國Caltag Laboratories公司)；羊抗兔VEGF(美國Caltag Laboratories公司)；免疫組織化學S-P試劑盒(武漢博士德公司)；中期因子試劑盒(美國Pepro Tech公司)，劑量20微克/支，粉劑，批號：119195-B，用0.9%NaCl溶解配置成濃度1μg/10μl。

3.造模和分組:新西蘭大白兔(浙江大學實驗動物中心提供)，分為實驗組和對照組，每組32只，使用中期因子的為實驗組，使用生理鹽水的為對照組。實驗動物禁食禁欲6h，術前肌內注射青霉素60×104單位/只，3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)經耳緣靜脈注射麻醉，生效后，固定于手術臺，術區褪毛，碘酊、乙醇消毒，鋪無菌巾。取前臂尺側上段切口顯露尺骨近端，采用4.5mm電鉆于尺骨近端連續鉆孔并穿透雙側皮質形成4.5mm×9.0mm的骨缺損，造成骨折模型。將浸漬生理鹽水明膠海綿植入尺骨的缺損處為對照組，將浸漬10μg中期因子明膠海綿植入的為實驗組。術后第2天肌內注射青霉素60×104單位/只，連續3天，不做外固定，分籠喂養。各組兔子造模后，對照組每天在骨折模型部位注入生理鹽水0.5ml，連續7天。實驗組每天注入中期因子2μg，連續7天。

4.觀測指標:(1)標本的獲取和制作:造模術后分別在21、42、63、84天，實驗組和對照組各取8只，氯胺酮耳緣靜脈注射麻醉后處死大白兔，切取術側骨缺損處標本，標本保留中心兩端正常骨組織5mm，切開后放置于10%甲醛溶液中固定，然后制作成石蠟標本，切片，HE染色。測定骨缺損中心面切片的新生骨組織的面積比例，分析新骨生成的情況。光鏡下觀察兩組骨缺損修復情況。根據Lane-sandhu 組織學評分標準進行評分(表1)。(2)VEGF、CD34免疫組化檢測和觀察：石蠟標本二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶，微波法抗原修復。正常山羊血清室溫下孵育30min，然后滴加羊抗兔VEGF、CD34多克隆抗體(1∶150)，4℃冰箱過夜，復溫后滴加HRP標記的山羊抗小鼠IgG(一抗)，37℃溫箱孵育30min，0.01mol/L PBS洗，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水水洗藍化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用已知陽性組織作為陽性對照，用0.01mol/L PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。VEGF免疫組織化學染色后，陽性信號呈現黃褐色，位于胞質內，采用Simple PCI (Version 5.2.1，美國Hamama公司)對標本進行光密度測定分析。每張切片隨機選取5個高倍視野(×200)，以參數灰度值代表蛋白顆粒密度[1]。CD34標記MVD的結果判定：CD34陽性染色定位于血管內皮細胞，呈棕黃色。對CD34陽性的血管內皮細胞采取Weidner等MVD計數方法行血管計數，以任何一個棕黃色的細胞團或內皮細胞作為一根血管。先于低倍鏡下尋找血管高密度區，找到高密度區以后在高倍鏡下分別計數5個視野的微血管數，取其平均值作為每例的MVD[2]。(3)CT掃描及三維重建檢查：造模術后術后、21、42、63、84天給所有實驗動物進行手術側肢體CT掃描及三維重建，在兔麻醉狀態下由放射科從事CT掃描的專業技術人員行動物雙前臂行CT薄層掃描(層厚0.75mm)，掃描結束后，將原始數據輸入SIEMENS工作站，在Syngo軟件支持下行三維重建，以進一步明確具體直觀的骨缺損處的骨痂生長量及愈合情況，參照Hedberg標準進行新生骨面積等級療效評估。

表1 Lane-Sandhu組織學評分

結 果

1.大體病理和組織學觀察:在大體肉眼觀察，術后 21天：兩組骨缺損處呈梭形膨大并被包裹纖維組織，切面骨顆粒，剖面質地不均勻，兩組斷端骨缺損處骨痂增生明顯。42天：兩組梭形膨大縮小，硬度質地比周圍組織明顯增加，剝離困難。63天：兩組骨缺損均見愈合，骨痂質地堅硬，其邊緣呈薄殼狀皮質骨，剖面質地較均勻。84天：兩組骨缺損被堅硬骨痂填充，切面質地堅硬，均勻一致。骨痂連續性好，顏色、質地和正常骨質相似。在術后的常規組織學發現，術后21天，骨缺損可見到新生的幼稚的編織骨，新生骨小梁形成，該骨小梁纖細，排列不規則。術后42天，可見進一步成熟的骨小梁結構，骨小梁之間可見到膠原纖維組織。術后63天，骨缺損之間骨質進一步成熟，骨小梁增粗，骨髓腔形成，可見到骨髓成分。術后84天，膠原進一步成熟，新骨進一步成熟，可見骨髓腔再通，部分組織仍可見硬化，在塑性可能還要一段時間。根據組織學觀察，采用Lane-Sandhu組織學評分進行對比分析，組織學評分在21天和84天時未見明顯的區別，但在第42天實驗組與對照組比較，差異有統計學意義(t=2.63，P<0.05)；第63天實驗組與對照組比較，差異有統計學意義(t=2.63，P<0.05，表2)。

表2 實驗組和對照組Lane-Sandhu組織學評分

與對照組比較，*P<0.05

2.VEGF和CD34的觀察:骨缺損周圍肉芽組織的新生小血管內皮細胞、間充質細胞、軟骨細胞質內均可見呈棕褐色顆粒的VEGF蛋白(圖1)。實驗組和對照組間VEGF平均密度值比較，第42天和第63天差異均有統計學意義。在第21天和第84天差異無統計學意義(P>0.05，表3)。CD34蛋白陽性表達均位于大量增生的毛細血管內皮細胞質，在MVD計數第21天時兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但在第42天(圖2)、第63天和第84天兩組比較差異有統計學意義(P<0.05，表4)。

圖1 不同組VEGF 的表達(免疫組化染色，×10)A.對照組;B.實驗組

圖2 不同組CD34的表達(免疫組化染色，×10)A.對照組;B.實驗組

表3 實驗組和對照組VEGF蛋白表達

與對照組比較，*P<0.05

表4 實驗組和對照組MVD計數,條)

與對照組比較，*P<0.05

3.實驗動物橈骨CT掃描及三維重建骨痂分析:從實驗組結果可以看出,缺損修復后21天CT顯示骨缺損區可見骨痂形成，缺損區邊緣模糊，缺損中央仍清晰可見，三維重建顯示有缺損；第42周缺損區基本被骨痂填滿，缺損邊緣基本消失，CT冠狀位掃描及大體標本顯示缺損已基本愈合，但在三維重建片上仍顯示有缺損，這是由于是新生骨痂密度不夠高、而且較薄，所以在三維重建時顯示為缺損；第63周缺損區基本完全修復，在新生骨痂與周圍骨密度一致的情況下，二維重建提示實驗組仍可見較明顯的骨痂區，三維重建顯示缺損已完全修復；第84天缺損區已完全修復，在新生骨痂與周圍骨密度一致的情況下，三維重建顯示缺損已完全修復(圖3)。根據CT掃描后的圖像，在自帶軟件上描出骨痂面積并記錄分析(表5)。

圖3 中期因子組各階段骨痂形成情況的CT重建A.造模后0天;B.造模后21天;C.造模后42天;D.造模后63天;E.造模后84天

表5 CT重建下骨痂面積

與實驗組比較，*P<0.05

討 論

中期因子(midkine,MK) 是1988 年日本學者Kadomatsu 等發現的一種新蛋白，在胚胎發育早期至中期時,在多種組織中表達強烈。MK是一種重要的血管生成誘導因子，對腫瘤新生血管的形成具有明顯的調控作用。

骨折的愈合離不開血液供應，血管的長入對骨折愈合具有重要的意義，在骨折愈合過程中，成骨細胞和破骨細胞均可以分泌血管內皮細胞生長因子(VEGF)，VEGF在激活血管內皮細胞受體后，和其他血管生長因子具有協同作用，能促進血管內皮細胞增殖、分化，使血管的通透性增加，使得高分子物質進入到細胞外基質，使細胞外基質發生改變、從而促進了血管新生[1，2]。VEGF是新生血管內皮細胞增殖、趨化過程中的特異性生長因子，并介導肥大軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的正常分化和功能，對軟骨內成骨及骨折愈合的血管入侵發揮重要作用。研究表明，骨折后骨折端VEGF可在多種不同的細胞中表達，在骨折端的血管內皮細胞中可以檢測到有VEGF受體存在，說明VEGF參與了骨折愈合過程[3]。在骨折愈合的軟骨內化骨過程中，由新生的微血管提供一些因子和成骨細胞至骨折處，促使間充質細胞向成骨方向分化，當軟骨組織連接了骨折端，隨著新生血管的入侵及成骨細胞增生分化，與破骨細胞一起對肥大軟骨骨痂進行骨沉積及骨改建。CD34分子是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，隨細胞的成熟逐漸減弱至消失，在血管內皮細胞也有較高的表達，所以可以在研究中分析微血管生成的量的多少。

Hanahan[4]認為血管生成受血管生成促進因子和血管生成抑制因子的雙向調控，在生理狀況下血管生長受到精確的調控，當兩個作用相反的調控因子失去平衡則會出現異常的血管生長。促進血管生成的因子主要為VEGF、bFGF、Ang、PDGF、TGF-β和EGF等。在已知的促血管生成因子中，VEGF 是唯一的分泌型蛋白，具有促進血管生成和調節骨細胞活性的作用，是一種較強的具有誘導血管及骨生成作用的細胞因子[5，6]。VEGF 對內皮細胞的增生有強烈的刺激作用,可誘導血管新生(angiogenesis)，增加血管的通透性。重組的VEGF在對缺乏血管生成和骨原細胞的環境下能促進生成具有活性功能的骨，并可能對不愈合骨折有效[7]。VEGF能促進骨折愈合主要是促進血管的生成和提高骨轉化，并發現VEGF在體外能直接提高成骨細胞的活性[8]。

從理論上分析，MK提高血管的生成，也同時可能提高VEGF的表達，就有可能促進骨的愈合。但在最近的研究使用MK基因缺乏小鼠，發現在去勢后，骨質疏松情況明顯好于野生型的小鼠，但在體外卻可以促進成骨細胞的分化[9]。另有研究不提示在MK缺乏的小鼠的尺骨骨折模型中，給以尺骨力學刺激，發現野生型小鼠有明顯的合成作用[10]。研究發現,MK在骨折愈合過程中的間充質細胞和軟骨細胞中一直有表達，并隨時間的延長減弱，MK cDNA在轉入ATDC5軟骨細胞后，出現高表達并能促進軟骨的形成，從而促進骨形成，提高骨折的愈合[11]。出現如此不同的結果，可能和研究的方法不同有密切關系。MK的直接作用和MK基因缺乏小鼠在對骨折愈合的過程影響和涉及因素不同導致不同的實驗結果。

本研究中在骨缺損修復的的不同時期，VEGF 蛋白水平表達各異。實驗中發現聚集在骨缺損周圍的VEGF 陽性細胞主要是一些小血管內皮細胞及間充質細胞或纖維母細胞，這說明中期因子能誘導周圍組織內的血管長入，實驗形態學也說明了這一點[5]。所以在中期因子的誘導下，誘導作為促進血管生成重要因子VEGF大量生成，骨缺損邊緣有毛細血管長入，這和本研究VEGF 表達越強的區域 MVD 計數越高密切相關。VEGF 通過與內皮細胞膜受體結合，通過調節血管通透性、血管內皮細胞的增殖、從而促進微血管生成而促進骨的修復[6]。

骨組織形態計量學結果顯示，兩組骨修復最終未見明顯差異，同時兩組間 VEGF 蛋白表達與骨形態計量學參數之間相關性分析表明， VEGF 的表達水平的高低與新生骨量之間有密切的關系，VEGF通過促進微血管的增生，從而能促進新骨形成。在實驗中筆者還發現，VEGF主要在增殖的成骨細胞及一些破骨細胞和血管內皮細胞的細胞質內表達，所以，筆者推測VEGF具有協調/破骨細胞和軟骨細胞之間的平衡、促進軟骨內成骨并改造細胞外基質。隨著骨重建的完成，上述細胞逐漸減少，VEGF和CD34的表達也逐漸減弱。筆者實驗結果顯示，MK可以通過促進VEGF的表達來強化骨修復中成骨細胞分化，同時增加骨改建中血管的生成，加速細胞外基質的改建，從而增加了骨形成?；谏鲜鰧嶒灲Y果可以得出 MK對修復骨缺損有促進作用，也更進一步表明MK可以作為治療骨缺損的藥物。

1 Wang C, Huang K, Sun Y,etal. VEGF modulates angiogenesis and osteogenesis in shockwave-promoted fracture healing in rabbits[J].JSR,2011,171(1):114-119

2 K?ttstorfer J,Kaiser G, Thomas A,etal. The influence of non-osteogenic factors on the expression of M-CSF and VEGF during fracture healing[J]. Injury,2013,44(7):930-934

3 Maes C, Goossens S, Bartunkova S,etal. Increased skeletal VEGF enhances β-catenin activity and results in excessively ossified bones[J]. The EMBO Journal, 2010,29(2): 424-441

4 Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance[J]. Science, 1997,277(5322):48-50

5 王垚,李琪佳,孫瑞軍,等. VEGF及微血管密度在同種異體骨及自體骨移植修復兔橈骨缺損中的表達[J]. 中國修復重建外科雜志, 2010,24(2):230-234

6 Kanczlera JM, Gintyb PJ,White L,etal. The effect of the delivery of vascular endothelial growth factor and bone morphogenic protein-2 to osteoprogenitor cell populations on bone formation[J]. Biomaterials, 2010,31(6): 1242-1250

7 Ramazanoglu M, Lutz R,Ergun C,etal. The effect of combined delivery of recombinant human bone morphogenetic protein-2 and recombinant human vascular endothelial growth factor 165 from biomimetic calcium-phosphate-coated implants on osseointegration[J]. Clinical Oral Implants Research. 2011,22(12):1433-1439

8 Ogilvie CM,Lu C, Vascular endothelial growth factor improves bone repair in a murine nonunion model [J]. Iowa Orthop J, 2012, 32: 90-94

9 Claudia N,Catala-Lehnen P,Beil FT,etal. Increased trabecular bone formation in mice lacking the growth factor midkine[J]. JBMR, 2010,25(8):1724-1735

10 Liederta A,Mattauscha L,R?ntgen V,etal. Midkine-deficiency increases the anabolic response of cortical bone to mechanical loading[J]. Bone, 2011,48(4):945-951

11 Liedert A,Schinke T, Ignatius A,etal. The role of midkine in skeletal remodelling[J]. British Journal of Pharmacology, 2014,171(4):870-878

(修回日期：2015-02-23)

Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Effects in Bone Healing Process byMidkine on Rabbit Fracture Model.

LiXiongfeng,LiJianyou,ZhouGuoshun,etal.

HuzhouCentralHospitalofZhejiangProvince,Zhejiang313000,China

Objective To explore the angiogenesis in bone healing process stimulated by midkine on rabbit fracture model. Methods Rabbit Ulna fracture model, putted MK gelatin sponge to the bone fracture defects and inject MK everyday continuing one week on experimental group, control group just use physiological saline gelatin sponge inject physiological saline at same time. Harvested the examples at 21,42,63,84 days respectively. Bone formation was evaluated according to the Lane-Sandhu criteria, analyzed the expression of VEGF and CD34 by immunohistochemisty. Results According to the Lane-Sandhu criteria，we found that at 42 days and 63 days the bone healing of experimental group was better than control group, as same as the expression of VEGF. The expression of CD34 in experimental group was better than control group at 21,42,63 days respectively. Conclusion We considered that MK promoting the bone formation in rabbit fracture model by induce neovascularization. It could be used to enhanced the healing of fracture.

Midkine; Fracture; Angiogenesis; VEGF

浙江省醫藥衛生科技項目(2009B153)；湖州市科技計劃項目(2009YS04)

313000 浙江省湖州市中心醫院(浙江大學湖州醫院) 骨科

管國華，主任醫師，電子信箱：slinfer@126.com

R658

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.013

2015-01-08)